实时荧光定量RT-PCR法建立版纳微型猪近交系中厚皮创面转化生长因子表达体系*◆

背景：版纳微型猪近交系能较好的模拟人取皮区创面,构建动物模型,检测与创面愈合及瘢痕形成密切相关的转化生长因子的表达。 目的：观察创面愈合过程中转化生长因子β1基因的表达情况。 方法：利用版纳微型猪近交系4~6月龄猪构建了皮肤创面愈合动物模型,通过提取皮肤创面总RNA,设计特异引物,对与创面愈合相关密切的转化生长因子β1基因进行了RT-PCR扩增。纯化目的片段并与pMD18-T载体连接,转化宿主菌DH5α,提取重组质粒DNA,并经酶切、PCR和测序鉴定,计算重组质粒原液拷贝数浓度并制备梯度浓度标准品,进行实时荧光定量PCR。 结果与结论：建立的转化生长因子β1基因mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法特异性较好,检测灵敏度可达103 拷贝/µL,线性范围达103~109拷贝/µL,阈值循环数与PCR体系中起始模板量的对数值之间存在良好的线性关系(R2=0.988),扩增效率高(E=107.433%)。利用该检测体系检测了45份样品,效果良好,该方法可为研究TGF-β1基因在创面愈合过程中的作用机理奠定分子生物学基础。     

版纳微型猪近交系133家系SLA-DQ cDNA的克隆和序列分析

目的 建立小鼠在体肿瘤多药耐药模型。方法 模拟临床以亚于治疗剂量的联合化疗PFC方案，诱导S180腹水型小鼠4周，流式细胞仪荧光检测P170、LRP、TOPOⅡ，建立能客观反应临床肿瘤多药耐药产生机制并适合中药干预肿瘤多药耐药研究的在体细胞模型。结果 化疗诱导后昆明小鼠S180腹水肿瘤细胞P170、LRP的表达率和ROPOⅡ活性明显提高，经传代后其表达稳定。结论 联合化疗诱导建立小鼠在体肿瘤多药耐药模型是可行的。     

版纳微型猪近交系TNF-α基因mRNA实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的 快速、灵敏、可靠的检测与临床多种疾病密切相关的重要基因TNF-α的表达情况,构建TNF-α基因及内参GAPDH基因荧光定量PCR质粒标准品.方法 利用版纳微型猪近交系4～6月龄猪建立动物模型,提取皮肤创面总RNA,设计特异引物.进行RT-PCR扩增.纯化目的片段与pMD18-T载体连接,转化宿主菌DH5α,提取重组质粒DNA,并经酶切、PCR和测序鉴定,计算重组质粒原液拷贝数浓度并制备梯度浓度标准品,进行实时荧光定量PCR,生成标准曲线.结果 建立的TNF-α基因和GAPDH内参基因mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法灵敏度分别可达10<''3>和10<''5>拷贝,线性范围分别为10<''3>～10<''9>和10<''5>～10<''9>拷贝,阈值循环数(Ct)与PCR体系中起始模板量的对数值之间存在的线性关系R<''2>分别为0.993和0.999,扩增效率E分别为111.073%和95.948%.结论 成功的构建了版纳微型猪近交系TNF-α基因质粒标准品和标准曲线,并用内参基因GAPDH进行校正,此方法可为探讨TNF-α基因在临床多种疾病中所发挥的分子机理奠定基础.     

版纳微型猪近交系SRY基因编码区序列克隆及生物信息学分析

目的获得版纳微型猪近交系(BMI)SRY基因编码区序列并进行分子系统进化研究。方法以看家基因GAPDH为内参,对BMI猪的SRY基因编码区序列进行PCR扩增、克隆和序列分析,并应用Lasergene、Bi-oEdit、ClustalX、MEGA等生物信息学软件同鲸鱼、海豚、鹿、绵羊、牛、海豹、马、海象、熊猫、人、驴、熊、猫、虎和美洲豹等15个物种相应SRY编码区核苷酸序列和氨基酸序列进行了比对分析,在此基础上采用NJ和ME法对其编码区氨基酸序列构建了分子系统进化树。结果 BMI猪SRY基因编码区序列长711 bp,编码236个氨基酸,GenBank登录号为GU991615。BMI猪与鲸鱼、海豚、鹿、绵羊、牛、海豹、马、海象、熊猫、人、驴、熊、猫、虎和美洲豹的SRY基因编码区核苷酸序列相似性分别为83.7%、82.8%、78.4%、78.0%、76.9%、73.3%、73.1%、73.0%、72.9%、72.7%、72.7%、72.2%、71.6%、71.3%、70.8%,相应的氨基酸序列相似性分别为72.8%、54.5%、67.3%、64.5%、61.5%、61.9%、59.5%、61.4%、62.0%、59...     

版纳微型猪近交系GHR基因克隆及生物信息学分析

目的 获得版纳微型猪近交系（BMI）生长激素受体基因（GHR）序列,通过生物信息学分析预测GHR功能并进行GHR mRNA多组织表达谱分析。方法 以版纳微型猪近交系的肝脏组织为材料提取RNA,RT-PCR方法扩增GHR基因编码区序列,将序列连接至pMD18-T载体进行克隆、测序和生物信息学分析;半定量PCR检测GHR mRNA在BMI不同组织中表达量的差异。结果 克隆出了BMI GHR 编码区序列,提交GenBank获得登录号KC999114。该基因CDS长1917 bp,编码638个氨基酸。生物信息学分析表明,与长白猪的GHR序列相比BMI存在4处氨基酸替换,分别为p. E381D、p. A409S、p. L556V和p. A580G,均发生在胞内域。GHR基因多组织表达谱分析显示：GHR mRNA几乎在各组织中均有表达,在肌肉中表达量最高,在小肠、心、肝、神经纤维、脾、卵巢中表达量较高,在肺、胃、大脑、胰和肾中的表达量较低。结论 成功克隆了版纳微型猪近交系GHR全长编码区序列,进行了生物信息学功能分析和组织表达谱分析,为进一步阐明版纳微型猪近交系生长矮小机理奠定了基础。     

实时荧光定量RT-PCR法建立版纳微型猪近交系中厚皮创面转化生长因子表达体系

背景:版纳微型猪近交系能较好的模拟人取皮区创面,构建动物模型,检测与创面愈合及瘢痕形成密切相关的转化生长因子的表达。目的:观察创面愈合过程中转化生长因子β1基因的表达情况。方法:利用版纳微型猪近交系4～6月龄猪构建了皮肤创面愈合动物模型,通过提取皮肤创面总RNA,设计特异引物,对与创面愈合相关密切的转化生长因子β1基因进行了RT-PCR扩增。纯化目的片段并与pMD18-T载体连接,转化宿主菌DH5α,提取重组质粒DNA,并经酶切、PCR和测序鉴定,计算重组质粒原液拷贝数浓度并制备梯度浓度标准品,进行实时荧光定量PCR。结果与结论:建立的转化生长因子β1基因mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法特异性较好,检测灵敏度可达103拷贝/μL,线性范围达103～109拷贝/μL,阈值循环数与PCR体系中起始模板量的对数值之间存在良好的线性关系(R2=0.988),扩增效率高(E=107.433%)。利用该检测体系检测了45份样品,效果良好,该方法可为研究TGF-β1基因在创面愈合过程中的作用机理奠定分子生物学基础。     

实时荧光定量RT-PCR法建立版纳微型猪近交系中厚皮创面转化生长因子表达体系

背景：版纳微型猪近交系能较好的模拟人取皮区创面,构建动物模型,检测与创面愈合及瘢痕形成密切相关的转化生长因子的表达。 目的：观察创面愈合过程中转化生长因子β1基因的表达情况。 方法：利用版纳微型猪近交系4~6月龄猪构建了皮肤创面愈合动物模型,通过提取皮肤创面总RNA,设计特异引物,对与创面愈合相关密切的转化生长因子β1基因进行了RT-PCR扩增。纯化目的片段并与pMD18-T载体连接,转化宿主菌DH5α,提取重组质粒DNA,并经酶切、PCR和测序鉴定,计算重组质粒原液拷贝数浓度并制备梯度浓度标准品,进行实时荧光定量PCR。 结果与结论：建立的转化生长因子β1基因mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法特异性较好,检测灵敏度可达10³拷贝/µL,线性范围达10³~10⁹拷贝/µL,阈值循环数与PCR体系中起始模板量的对数值之间存在良好的线性关系(R2=0.988),扩增效率高(E=107.433%)。利用该检测体系检测了45份样品,效果良好,该方法可为研究TGF-β1基因在创面愈合过程中的作用机理奠定分子生物学基础。     

版纳微型猪近交系TDRP1基因克隆、鉴定及mRNA的组织表达特性

目的 克隆版纳微型猪近交系(BMI)不育和可育公猪TDRP1基因,分析其序列及mRNA表达水平上的差异,预测其蛋白质功能,并检测该基因在可育公猪中的组织表达分布情况.方法 以猪NM_001198925序列为模板,设计特异引物,采用RT-PCR方法结合测序获得TDRP1的cDNA序列并进行生物信息学分析;采用半定量PCR方法检测TDRP1在不育和可育公猪睾丸中的表达规律,分析该基因在可育公猪17种组织中的表达特征.结果 获得了BMI TDRP1基因的编码区序列(GenBank登录号:KJ186786),生物信息学分析表明其编码186个氨基酸,蛋白质相对分子质量(Mw)为20.49 ×10³,等电点(pI)为5.86,无信号肽,有94.1%的概率位于细胞核,含有1个亮氨酸富集的核输出信号.不同物种的氨基酸序列比对表明猪TDRP1与人、恒河猴、小鼠和大鼠等哺乳动物的TDRP1相似性在73%～83.2%之间,其中与人、恒河猴的相似性较高.mRNA表达分析表明,TDRP1在BMI不育和可育公猪睾丸间表达水平差异无显著,在精囊腺和前列腺中高表达,在睾丸和小脑中中度表达,在大脑和肾脏中低表达,在其余组织中不表达.结论 成功克隆了BMI TDRP1基因的全长编码区序列并发现了BMI特有的2个SNP位点;TDRP1基因在BMI不育和可育公猪间序列完全一致,睾丸mRNA表达水平差异无显著性,多组织转录谱分析表明该基因存在明显的组织差异表达现象,在精囊腺和前列腺中有较高表达量,为深入研究TDRP1基因在精子发生方面的作用奠定了基础.     

实时荧光定量RT-PCR法建立版纳微型猪近交系中厚皮创面转化生长因子表达体系

背景：版纳微型猪近交系能较好的模拟人取皮区创面,构建动物模型,检测与创面愈合及瘢痕形成密切相关的转化生长因子的表达。目的：观察创面愈合过程中转化生长因子β1基因的表达情况。方法：利用版纳微型猪近交系4～6月龄猪构建了皮肤创面愈合动物模型,通过提取皮肤创面总RNA,设计特异引物,对与创面愈合相关密切的转化生长因子β1基因进行了RT-PCR扩增。纯化目的片段并与pMD18-T载体连接,转化宿主菌DH5α,提取重组质粒DNA,并经酶切、PCR和测序鉴定,计算重组质粒原液拷贝数浓度并制备梯度浓度标准品,进行实时荧光定量PCR。结果与结论：建立的转化生长因子β1基因mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法特异性较好,检测灵敏度可达103拷贝/μL,线性范围达103～109拷贝/μL,阈值循环数与PCR体系中起始模板量的对数值之间存在良好的线性关系（R2=0.988）,扩增效率高（E=107.433%）。利用该检测体系检测了45份样品,效果良好,该方法可为研究TGF-β1基因在创面愈合过程中的作用机理奠定分子生物学基础。