UPLC-MS/MS研究披针灰叶素B在不同种属肝微粒体中的代谢稳定性及代谢酶表型

应用体外肝微粒体孵育体系,研究披针灰叶素B(lanceolatin B)在大鼠、人、比格犬、猴肝微粒体中的代谢稳定性及体外代谢参数,确定主要代谢披针灰叶素B的CYP酶表型。将披针灰叶素B与不同种属肝微粒体共同孵育,应用UPLC-MS/MS检测孵育液中披针灰叶素B的含量,考察其代谢稳定性与体外代谢动力学参数。将披针灰叶素B与各CYP450同工酶CYP2E1,2C19,1A2,2D6,2C9,3A4,2A1的特异性抑制剂共同孵育,确定其代谢酶表型。研究结果显示,披针灰叶素B在人、比格犬肝微粒体中不代谢,而在大鼠与猴肝微粒体中可代谢,它们的体外半衰期(T_(1/2))与固有清除率(CL_(int))分别为11.57,8.07min和0.12,0.17 m L·min-1·mg-1,结果没有显著性差异;披针灰叶素B在肝微粒体中的代谢存在种属差异,在大鼠肝微粒体中由多个酶共同参与代谢,其中CYP1A2酶的作用最强,是主要代谢披针灰叶素B的酶。     

人凋亡相关新基因PNAS-4的克隆、原核表达与纯化

目的克隆人的凋亡相关新基因PNAS-4到原核表达载体,表达并纯化人的PNAS-4蛋白。方法用RT-PCR的方法从人肺腺癌A549细胞中扩增出人的PNAS-4基因。将其克隆到pGEX-6P-1载体,转化到大肠杆菌BL21。用IPTG诱导表达,并用亲和层析的方法纯化出人的PNAS-4蛋白;然后使用质谱分析鉴定纯化后的蛋白质。结果扩增出的人PNAS-4基因与GenBank上的序列完全一致。纯化的人PNAS-4融合蛋白在相对分子质量约50×103处可见特异性条带;经质谱鉴定证实所纯化的蛋白质为PNAS-4融合蛋白。结论成功表达和纯化了人PNAS-4蛋白,为今后对人PNAS-4基因的功能研究打下基础。     

吖啶酮衍生物H64在5种种属肝微粒体中的代谢产物分析

目的：应用肝微粒体体外孵育体系,对吖啶酮衍生物H64在人、SD大鼠、小鼠、恒河猴和比格犬的肝微粒体中的代谢产物进行鉴定,并提出H64的主要体外代谢途径。方法：生物样品经过前处理,乙腈和0.1%甲酸水溶液为流动相,通过UHPLC-Q-Exactive Plus液质进行分析,使用Xcalibur 4.2以及Compound Discoverer^TM 2.0软件对数据进行处理,及后期的人工筛选,鉴定H64在5种种属肝微粒体中可能的代谢产物。结果：共检测到11个代谢产物,其中9个为Ⅰ相代谢产物,包括氧化以及脱氧还原的代谢物;其余2个为Ⅱ相代谢产物,包括甲基化、乙酰化的代谢物。在人、SD大鼠、小鼠、恒河猴和比格犬的肝微粒体中分别检测出了9、6、7、7、7种代谢产物。结论：H64在各种属肝微粒体中,最主要的代谢途径为氧化。本研究能反映H64的体内代谢产物的大致情况。小鼠和人肝微粒体中的代谢产物种类最为接近,为H64早期代谢研究的实验动物的选择上提供了参考。     

纳升超高效液相色谱-飞行时间质谱检测斑马鱼胚胎中小分子多肽的初步研究

目的 探讨纳升超高效液相色谱-飞行时间质谱(nano-UPLC-TOF-MS)检测斑马鱼胚胎中小分子多肽的方法.方法 收集受精后发育24 h的斑马鱼胚胎,去除外层胶膜,采用机械力破碎法去除斑马鱼早期胚胎中的卵黄,并用显微镜和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测去除效果,然后用小分子肽提取液获得肽液样品后,用nano-UPLC-TOF-MS检测小分子肽相对分子质量.结果 经处理的胚胎卵黄几乎完全被去除,nano-UPLC-TOF-MS结果显示在22～24.5 min处有一明显的样品峰,单质量/电荷比(m/z)显示,绝大部分肽段峰位于800～1400 m/z范围内.结论 Nano-OPLC-MS是检测小分子多肽的有效方法,早期斑马鱼胚胎中存在着小分子多肽,其相对分子质量集中在800～1400范围内.     

厚朴提取物HK-1在5个种属肝微粒体中的代谢

目的研究厚朴抗炎有效成分(E)-5-allyl-3'-(prop-1-enyl)biphenyl-2,4'-diol(HK-1)在人、大鼠、比格犬、猴和小鼠的肝微粒体中的代谢稳定性,确定HK-1在大鼠肝微粒体中代谢表型。方法将HK-1在5个种属肝微粒体中孵育,采用UPLC-MS/MS检测方法,通过测定HK-1的剩余浓度,考察它们的代谢稳定性并外推其体内代谢清除率。化学抑制剂法鉴定在大鼠肝微粒体中HK-1的代谢表型。结果 HK-1在人、大鼠、比格犬、猴和小鼠5个种属肝微粒体中半衰期(t_(1/2))分别为9.04、7.36、2.17、4.94、18.09 min;肝微粒体中固有清除率CL_(int)分别为153.40、188.20、639.02、280.60、76.60 m L/(min·mg蛋白);体内固有清除率CL'_(int)分别为151.87、338.76、949.21、416.69、301.61 m L/(min·kg)。在大鼠肝微粒体中HK-1主要被细胞色素CYP2E1、CYP2C、CYP1A2催化代谢。结论HK-1在肝微粒体中由多种酶代谢且代谢很快,其中人肝微粒体和大鼠肝微粒体中半衰期和固有清除率相似,可将大鼠肝微粒体预估人肝微粒体不良反应的风险。     

抗肿瘤化合物E7在不同种属肝微粒体酶中的体外代谢研究

采用商品化的人、Beagle犬、食蟹猴、SD大鼠的肝微粒体酶,考察E7在4个种属肝微粒体中的代谢稳定性,比较代谢的种属差异。采用选择性化学抑制剂,测定不同抑制剂对E7代谢速率的影响,分析预测大鼠肝微粒中参与E7代谢的主要亚酶。实验结果显示E7在人、犬、食蟹猴和大鼠4个种属的肝微粒体中体外代谢半衰期T1/2分别为57.75,69.30,16.90,30.13min;体外固有清除率分别为0.004 8,0.004 0,0.016 4,0.009 2 m L·min~(-1)·mg~(-1)。推测E7在人和犬肝微粒体中代谢速率相近,均比较慢;在猴和大鼠肝微粒体中代谢速率相近,均比较快;代谢速率存在明显的种属差异。CYP2E1,CYP2A6,CYP1A2和CYP2D6均可能参与代谢E7,而多态性的CYP3A4对其的代谢贡献较小。     

UPLC/MS/MS法同时测定人血浆中人参皂苷Re和Rg1含量及对参附冻干粉针剂的药代动力学评价

目的 在人血浆中建立一种快速灵敏的同时测定人参皂苷Re和Rg1含量的超高效液相色谱串联质谱(UPLC/MS/MS)检测方法.方法 采用Acquity UPLCTM BEH C18分析柱(1.7 μm, 2.1×100 mm),三重四级杆质谱检测器,在多反应检测模式(MRM)下分别选择质荷比(m/z) 969.6 →789.3、 m/z 823.5→643.2 和m/z 803.5 →387.1对Re、Rg1和内标地高辛进行检测.18名健康志愿者提供的324份血浆样品用该方法进行检测,并进行参附冻干粉针剂的药代动力学研究.结果 每个样品仅需要50 μL的血浆,洗脱时间仅需4 min.Re和Rg1的最低检测限均为0.025 ng/mL.在0.1～200 ng/mL内线性关系良好(r2>0.999).人参皂苷Re及Rg1在人血浆中的药动学参数均符合三室开放模型.结论 本法具有灵敏、快速的特点,适用于人参皂苷Re、Rg1血药浓度的同时测定以及静脉滴注参附冻干粉针剂药代动力学的研究.     

水黄皮素在大鼠肝微粒体中的代谢研究

目的 研究水黄皮素在大鼠肝微粒体中的代谢稳定性,确定水黄皮素的代谢酶表型.方法 将水黄皮素与大鼠肝微粒体于37℃孵育,应用UPLC-MS/MS法检测孵育液中水黄皮素的含量,考察水黄皮素的代谢稳定性.将水黄皮素与各细胞色素P450(CYP)酶中的各同工酶CYP2E1、2C19、1A2、2D6、2C9和3A4的特异性抑制剂共孵育,确定其代谢酶表型.结果 在大鼠肝微粒体中,水黄皮素的t1/2=1.97 h、Cl =0.70 mL·h-1 ·mg-1,CYP1 A2是其主要代谢酶.结论 水黄皮素在大鼠肝微粒体中是由多个CYP同工酶介导代谢的,其中,CYP1 A2酶的介导作用最强.     

阳离子脂质体-非编码质粒DNA复合物抗小鼠结肠癌的实验研究

目的:探讨利用阳离子脂质体-非编码质粒DNA复合物治疗小鼠结肠癌以及作用机制。方法:建立小鼠结肠癌肺转移和皮下肿瘤模型,静脉给予阳离子脂质体-非编码质粒DNA复合物进行治疗,测量瘤体大小,计数肺转移瘤的数量,观察各个脏器的病理学改变。结果:经阳离子脂质体-非编码质粒DNA复合物治疗后,治疗组的肺转移瘤的数量(肺转移模型中)和瘤体体积(皮下肿瘤模型中)明显低于对照组,治疗组小鼠的脾脏中巨核细胞数量明显增多。结论:阳离子脂质体-非编码质粒DNA形成的复合物具有治疗小鼠结肠癌的作用。     

伊曲康唑胶囊微丸在蒸馏水、牛奶、可乐中溶出度分析

目的临床上发现用可乐或牛奶送服伊曲康唑胶囊可提高其生物利用度和治疗效果,本研究旨在比较伊曲康唑胶囊微丸在蒸馏水、牛奶(全脂、低脂以及脱脂牛奶,伊利乳业)和可乐(可口可乐)中的溶出度。方法进行伊曲康唑微丸溶出度试验,采用液相色谱-串联质谱法对伊曲康唑微丸在溶出度试验中不同阶段的溶出浓度进行检测。结果自然pH的蒸馏水、牛奶、可乐中,伊曲康唑溶出度:可乐牛奶蒸馏水。从溶解平均最高浓度来看,可乐溶解伊曲康唑的能力约是牛奶的2.36~3.19倍,是蒸馏水的10.37倍。在蛋白质含量相同的情况下,全脂牛奶(脂肪6%)在牛奶中溶出能力最强。结论推荐临床上使用可乐或者全脂牛奶送服伊曲康唑胶囊,可增加药物溶出度,促进胃肠道吸收。