丙型肝炎病毒总抗原检测用于病程监测的研究

目的探讨丙型肝炎病毒(HCV)总抗原检测方法在丙肝病程监测方面的临床意义。方法对来本院就诊的40位丙肝患者于治疗前、治疗1个月时、治疗3个月时、治疗6个月(停药)时,停药6个月后等不同时期进行采血,收集血清或血浆标本,用抗-HCV检测试剂盒(酶联免疫法)、HCV核酸(RNA)扩增(PCR)荧光定量检测试剂盒、HCV总抗原检测试剂盒(酶联免疫法)进行检测。结果从患者确认感染丙肝到治疗结束抗-HCV检测均呈阳性,而HCV-RNA检测和HCV总抗原检测会随着病程的变化而变化。本次共检测了189例标本(40位患者不同时期标本总例数),其中HCV-RNA阳性51例,该51例阳性标本中,HCV总抗原检测阳性44例,阳性检出率为86.27%;138例HCV-RNA阴性标本,有3例HCV总抗原检测为阳性(2.2%)。2种方法比较,差异无统计学意义(χ2=1.6,P>0.05)。HCV总抗原检测其OD值会随着病程的变化而相应改变,可以较好地反应丙肝患者的病程状况。结论 HCV总抗原检测方法在丙肝病程监测方面具有很好的临床意义,适合在缺少荧光定量PCR检测能力的中小医院使用,可在一定程度上替代HCV-RNA检测,对抗-HCV阳性患者作进一步的验证检测或补充,更好地应用于丙肝患者的病程监测。     

重组人脂蛋白相关磷脂酶A2的原核表达及单克隆抗体制备

目的构建重组人脂蛋白相关磷脂酶A2(Lp-PLA2)的原核表达质粒,制备重组人Lp-PLA2,并通过免疫诱导获得人Lp-PLA2的单克隆抗体。方法以人cDNA文库为模板,通过PCR的方法获得PLA2G7基因的编码区序列,并与原核表达载体pET32a进行连接,构建原核表达质粒,转化大肠杆菌Rostta(DE3)。通过在30℃0.2mmol/L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)条件下诱导蛋白表达,经过纯化获得重组人Lp-PLA2;免疫Balb/c小鼠,制备单克隆抗体;并通过酶联免疫吸附试验法测定效价,检测抗体特异性。结果通过NotⅠ和SalⅠ双酶切及测序证实原核表达质粒构建成功;经纯化得到47×103左右的蛋白,与Lp-PLA2抗体进行蛋白免疫印迹法杂交呈阳性,表明已得到重组人Lp-PLA2。通过对小鼠免疫,最终获得单克隆抗体,效价为1∶2×106,与纤维蛋白原、C-反应蛋白无交叉反应。结论成功获得重组人Lp-PLA2,并制备得到了效价较高的单克隆抗体,为后续Lp-PLA2检测试剂盒的开发奠定了基础。     

新型冠状病毒中和抗体酶联免疫检测试剂盒的制备及应用

目的 开发一种新型冠状病毒中和抗体酶联免疫检测试剂盒,分析新型冠状病毒中和抗体在新冠疫苗效果监测中的临床应用价值。方法 表达纯化SARS-CoV-2病毒S蛋白RBD结构域和人ACE2蛋白,将RBD蛋白偶联HRP、ACE2蛋白偶联生物素(Bio),制备新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒;收集15例注射新冠疫苗志愿者血清,检测新冠疫苗注射前后机体中和抗体水平。结果 注射新冠疫苗前SARS-CoV-2中和抗体阳性率为0.00%,第1、2、3针新冠疫苗注射后11～15 d,阳性率分别为13.33%、93.33%、100.00%,第2针注射后第180～190 d,阳性率降低到33.33%;性能检测分析显示,最低检出限为0.06μg/mL,批内CV<5%,批间CV<10%,线性检测范围为0.030～3.125μg/mL,分析灵敏度验证值为0.040μg/mL,与微量细胞中和试验进行对比,确认与其具有高度一致性。结论 新型冠状病毒中和抗体酶联免疫检测试剂盒性能评价良好,检测方法具有快速、方便、易操作等特点,可以用于评估新冠疫苗的保护效果。     

新型冠状病毒IgM-IgG抗体检测试剂盒的制备及对15例患者临床应用初试

目的 开发一种快速检测SARS-CoV-2病毒的IgM-IgG抗体的胶体金免疫层析检测试剂盒,并优化研发及应用策略,分析IgM-IgG抗体联合检测在新冠病毒检测中的临床应用价值。 方法 表达纯化SARS-CoV-2病毒S蛋白的RBD和NTD结构域,通过胶体金制备工艺包被抗原及多克隆抗体,制备IgM-IgG抗体检测试剂盒;收集15例阳性患者的血清进行抗体检测分析,计算试剂盒检测的阳性率,分析SARS-CoV-2抗体IgM-IgG对病毒响应的过程。 结果 在15例核酸RT-PCR检测阳性的患者血清样本中,IgM-IgG联合抗体检测的阳性率为73.33%,其中IgM阳性占总标本数的53.33%,IgG阳性占总标本数的60.00%;5例境外人员中有3例为抗体阳性;对患者的流行病学分析发现,病毒感染1周以上的患者共7例,抗体检测全部为阳性;抗体检测试剂盒的灵敏度73.33%,特异性95.00%。 结论 IgM-IgG联合抗体检测法具有快速、方便、易操作等特点,可以作为核酸检测的辅助手段对疑似患者(尤其是境外人员及无症状患者)进行初筛;且IgM-IgG的检测结果可以作为推测患者病毒感染过程的依据;快速检测IgM-IgG抗体将为COVID-19疾病的诊断和治疗提供帮助。     

重叠延伸PCR法构建HCV多表位嵌合抗原

[目的]构建具有免疫活性的HCV多表位嵌合抗原。[方法]选取带有优势抗原表位区域的4段HCV多肽和-段HER-2多肽，找出对应碱基序列，扩增目的基因。然后通过重叠延伸PCR（OE-PCR）法将扩增的目的基因拼接，并克隆到原核表达载体中进行表达、纯化和活性检测。[结果]重叠延伸PCR法构建原核表达载体成功，其所表达的HCV-HER-2嵌合抗原为包涵体表达，经纯化和复性后具有良好的抗原活性。[结论]成功地构建了HCV多表位嵌合抗原，并表达和纯化了目的蛋白，确定了其抗原活性。     

丙型肝炎核心抗原酶联免疫检测试剂的临床应用

目的评价1种国产丙型肝炎病毒核心抗原(HCV-cAg)酶联免疫检测试剂的敏感性以及在临床应用效果。方法采用1种酶联免疫试剂盒(ELISA)检测HCV游离核心抗原,分别对2808名献血者、随机抽取的1099名门诊病人及244名抗-HCV阳性者血清作HCV-cAg检测,再进一步对献血者、门诊病人HCV-cAg阳性血清作HCV-RNA和抗-HCV检测,对244名抗-HCV阳性血清作HCV-RNA检测。结果献血者2808份血清,经HCV-cAg试剂检测出HCV-cAg阳性1例,此例血清HCV-RNA亦为阳性;随机抽取的1099份门诊病人血清标本,检测出HCV-cAg阳性8份,其中抗-HCV阳性5份(5/8),HCV-RNA阳性5份(5/6,有2份HCV-cAg阳性标本因血清不足未作RT-PCR和FQ-PCR);244名抗-HCV阳性的血清中检测出HCV-cAg阳性52份,HCV-RNA阳性49份(49/52),2种方法符合率为94.23%;另外,检测为HCV-cAg阴性的192份标本中,HCV-RNA阳性68份(68/192)。结论该HCV-cAg检测试剂在不同的临床样本中具有很好的应用价值。