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1.
目的:建立骨钙素酶免疫测定方法,并应用于临床检测血清骨钙素。方法:应用了3种检测模式,根据检测灵敏度、剂量反应曲线的形态进行分析,选择出合适的模式进一步应用于临床血清标本的骨钙素检测。结果:所采用的骨钙素单克隆抗体是钙离子依赖型的。固相抗原竞争法适合于临床定量测定骨钙素。最低可测限为1.4μg/L;20μg/L骨钙素样品批内CV=3.98%,批间CV=12.67%。测定正常献血员140名(年龄17-45岁),第5-95百分位点的骨钙素含量,男性为7.5-15.0μg/L女性为7.0-17.5μg/L。70例疑有骨质疏松症患者血清骨钙素含量2.91-30.20μg/L,以第95百分位点的骨钙素含量为cut-off值,升高5例。与进口试剂盒(Novocalcin,USA)相比较,有较好的相关性,r=0.81。结论:固相抗原竞争法酶免疫测定可以灵敏地检测血清中骨钙素含量,有实用价值。 相似文献
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目的 :制备纤溶酶 α2 抗纤溶酶复合物 (PAP)的单克隆抗体(mAb)。方法 :以从血浆中纯化的PAP免疫BALB/c小鼠。按常规方法融合 ,以固相等分子浓度的纤溶酶原、α2 抗纤溶酶(α2 AP)及PAP为抗原 ,建立间接ELISA筛选杂交瘤细胞培养上清 ,并对杂交瘤细胞分泌的mAb的特异性和亲和力进行鉴定。结果 :共获得 2 4株可稳定分泌特异性mAb的杂交瘤细胞。其中 ,针对PAP分子中纤溶酶结构的mAb 16株 ,针对α2 AP结构的mAb 1株 ,针对新抗原 (PAP分子中新出现的不同于前体分子纤溶酶原及α2 AP的抗原决定簇 )结构的mAb 7株。这些腹水中抗PAPmAb的滴度为 2× 10 -4~ 1× 10 -8,其中 4株mAb的亲和常数为 5 .6 2× 10 -9~ 3.5 8× 10 -11mol/L之间。结论 :成功地制备针对PAP新抗原的具有高亲和力的mAb ,为建立不受其前体分子干扰的PAP特异性检测方法 ,研究纤溶系统的激活状态提供了工具。 相似文献
3.
纤溶酶-α2抗纤溶酶复合物检测方法的建立和初步临床应用 总被引:1,自引:0,他引:1
目的 建立纤溶酶 α2 抗纤溶酶复合物 (PAP)的检测方法。方法 从血浆中纯化PAP作为免疫原制备单克隆抗体 (单抗 ) ,建立双抗体夹心法酶联免疫吸附试验 (ELISA) ,并对该法进行评价。结果 获取了特异针对PAP新抗原的单抗LW 3C10 ,和针对PAP及纤溶酶原 (Plg)的单抗LW 2B9。对PAP的亲和常数分别为 4 6 9× 10 10 mol/L、5 6 2× 10 9mol/L。以它们建立的夹心ELISA检测PAP在 0~ 15 0 μg/L范围内线性良好 ,批内、批间CV分别为 4 0 %~ 5 2 %、11 2 %~ 13 6 % ,回收率为 85%~ 10 5 % ,加入α2 抗纤溶酶 (α2 AP)及纤溶酶 α2 巨球蛋白复合物 (P α2 M)不干扰测定 ,与美国ADI公司PAP试剂盒相关良好 (r=0 96 2 9)。急性髓细胞白血病组、急性心肌梗死组、肝病组、健康老年人组的血浆PAP水平显著高于正常对照组 (P <0 0 0 1)。结论 该法可用于评估纤溶系统激活。 相似文献
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目的建立一种宽范围的定量检测人血清肌红蛋白(Mb)的磁珠分离酶联免疫测定法。方法使用国产聚苯乙烯磁珠,经碳化二亚胺活化表面自由羧基,得以与抗Mb单抗偶联,用此抗体包被磁珠作为固相,另一Mb单抗标记辣根过氧化物酶,做双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)检测人血清Mb,共检测临床血清标本50份,并与常规板式ELISA作对比。结果磁珠酶免疫定量检测方法用于人血清Mb定量检测范围可从常规板式ELISA的5~200μg/L扩展到5~1000μ/L。结论利用国产磁珠建立的磁珠分离酶免疫定量检测Mb方法优于常规板式ELISA。 相似文献
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B型钠尿肽基因的克隆和原核表达载体构建及纯化 总被引:1,自引:0,他引:1
目的: 克隆人B型钠尿肽(脑钠素,B-type natriuretic peptide,BNP)基因,纯化其表达蛋白并制备多克隆抗体。方法: 用PCR技术从正常成人心脏组织cDNA库中扩增出人BNP基因,将其克隆进pUCm-T中并测定核苷酸序列。构建大肠埃希菌分泌性表达载体pGXE4T-2/BNP,用异丙基β硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,GSH-agarose亲和纯化表达蛋白,用纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体。结果: 经PCR扩增成功获得96bp的BNP基因,测序正确,在大肠埃希菌中融合表达后,该蛋白的表达量占菌体总蛋白的19%,用SDS-PAGE和Westernblot鉴定大肠埃希菌中的表达产物,显示其相对分子量29500。经亲和纯化后GST-BNP的纯度可以达到95%,500ml菌液中得到纯化蛋白9.6mg。多克隆抗体的效价为1:32000。结论: BNP基因的克隆、表达和纯化成功以及多抗的获得,为建立BNP检测方法奠定了基础。 相似文献
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液相杂交技术在聚合酶链反应酶联免疫检测的应用 总被引:16,自引:1,他引:15
目的采用液相杂交技术,简化核酸杂交过程,建立乙肝病毒(HBV)的液相杂交的聚合酶链反应-酶联免疫检测(PCR-ELISA)方法。方法将5′端标记生物素的PCR扩增产物与5′端标记地高辛的探针呈液相混合,90℃2min,55℃1min杂交。杂交后产物被链霉亲和素酶标板固定,经酶标记抗地高辛标记抗体结合、显色。结果液相杂交酶联免疫检测条件优化探针浓度3pmol/次,酶标记抗体稀释度1∶1000。液相杂交时间3min,固相杂交时间120min,但其检测结果无明显差别。检测灵敏度1×10 相似文献
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氨基末端B型钠尿肽基因的克隆和原核表达载体的构建及纯化 总被引:3,自引:0,他引:3
目的 克隆人氨基末端B型钠尿肽(NT-proBNP)基因,构建原核表达载体并纯化其表达蛋白.方法 用聚合酶链反应(PCR)从正常成人cDNA库中扩增出人NT-proBNP基因,将其克隆进pUCm-T中测定核苷酸序列.构建大肠杆菌分泌性表达载体pGEX-4T-3-NT-proBNP,IPTG诱导表达,GSH-agarose亲和纯化该表达蛋白.结果经PCR扩增成功获得228 bp的NT-proBNP基因,测序正确,在大肠埃希菌中融合表达后,该蛋白的表达量占菌体总蛋白的23%,用SDS-PAGE和Western blot鉴定大肠埃希菌中的表达产物,显示其相对分子质量为34 600.经亲和纯化后的GST-NT-proBNP的纯度可以达到95%,得率为1.7 mg/100 ml.结论 NT-proBNP基因的克隆、表达和纯化成功,为建立NT-proBNP检测方法奠定了基础. 相似文献
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酵母双杂交文库筛选及N型钙离子通道与BART相互作用的初步分析 总被引:1,自引:0,他引:1
目的应用酵母双杂交技术筛选N型钙离子通道相关蛋白,并对候选蛋白BART(binder of arltwo)进行初步分析。方法用N型钙离子通道α1亚基C端630个氨基酸残基肽段(Calcium channel630a-mino acids,CaCh630)作为探针,运用酵母双杂交技术筛选出与之相互作用的基因。通过PCR扩增并克隆候选基因BART,然后分别构建带有红色荧光蛋白标签的表达载体pDsRed-BART和带绿色荧光蛋白标签的pEGFP-CaCh630,共转染海马神经元后,用激光共聚焦扫描显微镜观察这两个外源蛋白在细胞中的定位情况。结果应用酵母双杂交技术筛选出6个相关基因,体外共转染试验发现BART和CaCh630分子在海马神经元内有共定位现象,进一步证明其可能存在相互作用。结论BART可能在维持钙离子通道细胞骨架中定位起重要作用。 相似文献
9.
目的:制备凝血酶调节蛋白(thrombomodulin,TM)抗体。方法:原核表达目的蛋白,将表达的融合蛋白纯化后免疫小鼠。以EVC304包板的cell—ELISA检测抗体滴度,用Western blot和免疫组化鉴定抗体特异性。结果:目的蛋白在大肠杆菌中大量表达形成包涵体,将表达蛋白纯化并复性后免疫小鼠,3次免疫后得抗体效价为1:4000,经加强免疫后抗体效价达到1:8000;特异性较好。结论:在天然TM提取纯化困难的情况下,通过原核表达目的蛋白制备抗体是可行的。 相似文献
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本文用ELISA法检测50例IDDM患者的抗ss-DNA(IgG)、ds-DNA(IgG)和ACL(IgM、IgG)抗体,阳性率分别为18%、8%、26%和20%,明显高于对照组。用免疫荧光法检测27例IDDM患者ICA和ANA抗体,阳性率分别为29.5%和25.9%,高于正常对照5.0%和0。ICA(+)、(-)两组的SS-DNA、ds-DNA、ACL抗体阳性间无明显差异(P>0.05)。近期发病的IDDM患者ICA、ds-DNA及ANA明显高于发病较久的患者,而SS-DNA和ACL(IgG和IgM)两组间无差别。上感史对各自身抗体无明显影响(P>0.05)。 相似文献