人脐带间充质干细胞体外分化成骨细胞的研究

目的探讨人脐带源间充质干细胞(HUC-MSCs)定向诱导分化为成骨细胞的能力。方法人脐带经胶原酶和胰蛋白酶消化后于DMEM/F12培养基中培养,通过传代作纯化和扩增;采用倒置显微镜及电镜观察细胞形态,细胞计数绘制细胞生长曲线,流式细胞仪检测细胞免疫表型及细胞周期;以含有成骨细胞诱导剂(地塞米松、β-甘油磷酸钠、抗坏血酸)的DMEM/F12培养基对传至第3代的细胞定向诱导分化为成骨细胞,并对诱导后细胞作成骨细胞检测。结果经酶消化后,细胞贴壁生长,主要呈"成纤维样",但体积较大、形状不规则、细胞质突起多,细胞核大而疏松,核仁明显;第1、3、5、7代细胞生长曲线基本相同;细胞表面表达CD105、CD90、CD44、CD29及CD13,不表达CD34、CD45、HLA-DR;培养至第4代的细胞约72.724%的细胞处G1期、S期的细胞仅占18.069%,第6代时G1期细胞约为83.875%、S期为9.606%左右;细胞经成骨细胞诱导分化后,细胞形态发生改变,线粒体明显增多,出现较多的基质小泡、髓样体和空泡状结构,碱性磷酸酶染色显示呈强阳性,茜苏红染色和Von-Kossa染色显示细胞有钙盐沉积并形成钙结节。结论人脐带中分离及培养扩增细胞具有MSCs的基本特性,具有分化为成骨细胞的能力。     

负载卵巢癌冻融抗原对树突状细胞分泌细胞因子的影响

目的探讨负载卵巢癌冻融抗原对树突状细胞分泌细胞因子的影响。方法采用反复冻融法获得卵巢癌细胞株SKOV3细胞抗原,联合应用重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、重组人白细胞介素-4和重组人肿瘤坏死因子-α,体外诱导人外周血CD14^＋单核细胞为成熟DCs并负载卵巢癌肿瘤抗原;采用ELISA法检测培养细胞上清液中分泌IL-12p70、IFN-γ和IL-10含量,评价非成熟DCs和成熟DCs以及肿瘤抗原负载DCs和未负载肿瘤抗原DCs激活的CTL分泌细胞因子的能力。结果联合应用重组人的GM-CSF、IL-4和TNF-α可在体外诱导出成熟DCs;经ELISA方法检测,不同状态下的DCs分泌IL-12p70、IFN-γ的量不同,成熟DCs较非成熟DCs有更强的分泌IL-12p70、IFN-γ的能力（P〈0.05）,负载抗原DCs激活的CTL较未负载抗原DCs激活的CTL有更强的分泌IL-12p70[（182.89±4.57）pg/ml和（99.76±5.42）pg/ml,P〈0.01]和IFN-γ的能力[（102.11±5.95）pg/ml和（68.29±5.04）pg/ml,P〈0.01]。而成熟DCs分泌IL-10的能力与非成熟DCs相比,差异无统计学意义（P〉0.05）。负载抗原后DCs激活的CTL与未负载抗原DCs激活CTL上清液中IL-10的浓度相比,两者之间的差异无统计学意义（P〉0.05）。结论细胞因子的分泌量受DCs的成熟状态及某些刺激信号的影响,卵巢癌冻融抗原是其刺激信号之一。     

寒冷环境对大鼠血清中T_3T_4含量及鼠尾组织过冷特牲的影响

对13只寒冷环境(2～-8℃)和13只常温环境(15℃)下饲养的大鼠,在2个月进行三个方面的观察:(1)用放射免疫分析方法(RIA)测定血清中T_3、T_4的含量;(2)测定鼠尾组织过冷点和过冷时间;(3)测定实验前后大鼠体重的变化。结果发现:寒冷环境组比对照组体重减轻;T_3、T_4含量减少;过冷点升高和过冷时间缩短。     

人外周血树突状细胞低温保存的优化研究

目的探寻冻存树突状细胞(DCs)优化的冷冻保护剂组合。方法配制含不同浓度二甲基亚砜(DM-SO)的3种冷冻保护剂组合,A组:5%DMSO+6%羟乙基淀粉(HES)+4%人血清白蛋白(HAS);B组:10%DMSO+40%FCS;C组:12%DMSO+40%FCS,比较3组冷冻保护剂对人外周血CD14+单个核细胞诱导产生的成熟树突状细胞(mDCs)的冻存效果:采用两步法将mDCs冻存于-80℃冰箱过夜后转移至-196℃液氮气相中放置24 h,再将冻存的mDCs复苏后继续培养,并检测、比较冻存前后DC的形态、存活率、细胞表型及其对同种异体T细胞刺激活性的差异。结果 3组不同组合冷冻保护剂冷冻保存的mDCs复苏后其存活的细胞的形态没有发生明显改变,仍保留其成熟表型,并具备对T细胞的刺激活性。结论 3种不同浓度的DMSO冷冻保存mDCs,5%DMSO+6%HES+4%HSA组合更适宜。     

体外纯化培养外周血来源的树突状细胞的研究

目的建立来源于外周血的树突状细胞(DCs)的纯化培养方法并观察DCs的形态及功能。方法以Fi-coll密度梯度离心法从正常人外周血中分离出外周血单个核细胞(PBMNC)后,用体外培养的手段,采用培养黏附法或经免疫磁珠筛选法,获得单核细胞;分别加入不同浓度的细胞因子(重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子重组人白介素4重组人肿瘤坏死因子α)诱导培养,培养12 d诱导出DCs;用光镜和电镜观察培养的DCs,用流式细胞仪检测DCs表面的细胞表型(CD80、CD83、CD86、CD1α、HLA-DR),MTT法检测DC对T细胞的刺激增殖效应。结果在体外诱导出外周血来源的成熟DCs,电镜和光镜分析表明具有DCs的典型形态,所培养的细胞表面高表达CD80、CD83、CD86、CD1α、HLA-DR,并具有刺激异基因淋巴细胞增殖的能力。结论应用外周血来源的单个核细胞,采用培养黏附法或免疫磁珠分选法分选出的单核细胞,细胞因子培养12 d可得到成熟正常的DCs。     

人脐带源间充质干细胞临床输注前的优化制备

目的 探讨人脐带源间充质干细胞(HUC-MSCs)临床输注前制备成细胞悬液,细胞活性和细胞表面抗原的变化.方法 第3～5代人脐带源间充质干细胞用0.25％胰蛋白酶消化处理,PBS洗涤5次,分别重悬于磷酸盐缓冲液(PBS)或含有50 U/ml肝素-PBS、100 U/ml肝素-PBS、200 U/ml肝素-PBS中,放置于4℃、22C或37℃条件下,分别延长至1h、2h、3h,检测细胞存活率和细胞表面抗原的变化.结果 HUC-MSs收集后重悬于PBS中,在4℃条件下,随着在体外放置时间的延长,细胞的存活率在随之下降,但细胞存活率明显高于放置22℃、37℃条件下的细胞.将细胞收集后重悬于含有肝素的PBS溶液中,细胞既无聚集现象,而且随着肝素浓度的增加,细胞的存活率相对较高,体外短暂保存HUC-MSCs的效果较好.在含200 U/ml肝素的PBS溶液中,4℃条件下细胞放置3h后经苔盼兰染色镜下计数可知,HUC-MSCs存活率可维持在(91.3±3.08)％,而且HUC-MSCs表面仍高表达CD105、CD73、CD44、CD90.结论 临床输注前制备HUC-MSCs重悬于合200 U/ml肝素-PBS中在4℃条件下3h内可供临床有效输注.