不同途径的乳球菌介导重组IL-12基因抗小鼠黑素瘤的效果

利用自身免疫系统或其组分治疗肿瘤是一种新的治疗手段.白细胞介素-12(interleukin-12,IL-12)是一种具有多种生物学活性的免疫调节因子,它可以促进NK细胞和细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic lymphocyte,CTL)的活性,能刺激T细胞及NK细胞的增殖,并诱导分泌IFN-γ等多种细胞因子[1],因此在抗肿瘤及抗感染中起重要作用.与其他细胞因子一样,直接应用IL-12会导致全身不良反应甚至危及生命.2003年Huber等[2]发现通过滴鼻给药可以降低IL-12介导的不良反应,此外有研究表明利用质粒、腺病毒或腺病毒转染的间质干细胞靶发送IL-12基因到肿瘤部位表达也能抑制肿瘤生长[3-5],而不致产生严重的不良反应.然而质粒发送存在缺乏组织的特异性和靶向性、转染效率较低且基因表达时间短[6]等缺点,发送重组腺病毒载体易导致转染细胞毒性及死亡、基因表达时间受限、可诱导机体产生免疫反应[7]等,限制了这些方式临床应用的效果.     

P38MAPK信号通路在压力调控骨髓间充质干细胞膜片成软骨响应中的作用

目的 研究P38丝裂原激活的蛋白激酶（P38MAPK）信号通路在压力调控骨髓间充质干细胞（BMSCs）膜片成软骨响应中作用.方法 将含有抗坏血酸培养基构建的兔BMSCs细胞膜片分为空白对照组和加压组（静态液压加载装置给予细胞膜片120 kPa、1 h/d、连续4d的压力刺激）,采用Western blot及real time-PCR检测P38MAPK信号通路的表达,real time-PCR技术检测成软骨基因的表达.结果 兔BMSCs传代后细胞生长状态稳定,呈梭形;成骨诱导后,茜素红染色可观察到矿化结节,碱性磷酸酶活性染色呈阳性,成脂诱导后油红O染色细胞内出现红色脂滴;Western blot结果显示,与对照组（0.165 ±0.035）比较,压力刺激下兔BMSCs细胞膜片中P38MAPK蛋白表达量（0.820 ±0.108）显著升高（P＜0.05）,同时real time-PCR结果表明：加压组兔BMSCs细胞膜片中P38MAPK的mRNA表达量（0.651 ±0.105）高于对照组（0.166±0.046） （P ＜0.05）,且成软骨基因（Sox-9、Aggrecan及Col-Ⅱ）的mRNA表达量（3.323±0.729、0.901±0.162、1.151±0.105）也明显高于对照组（0.541±0.121、0.335±0.094、0.466±0.158）（P＜0.05）.结论 P38MAPK信号通路在压力调控BMSCs膜片成软骨响应中起正调节作用.     

优化密码子提高草原兔尾鼠ZP3融合蛋白的原核表达

目的:探讨提高草原兔尾鼠(Lagurus lagurus)卵透明带3(LZP3)基因在原核细胞中表达的水平。方法:利用重叠PCR技术,定点突变LZP3基因上3个稀有的密码子簇,将LZP3基因中7个稀有的密码子更换成大肠杆菌(E.coli)最常用的相应密码子。将获得的LZP3突变基因(LZP3m)插入pGEX4T-1中,构建重组表达载体。以重组体转化E.coliBL21(DE3)菌株进行表达。结果:LZP3m基因的表达量比野生型LZP3基因明显提高。结论:通过密码子优化,能显著提高LZP3基因在原核细胞中的表达水平。     

携带HPV16 E7 shRNA和IL-12基因的重组短双歧杆菌抗小鼠宫颈癌移植瘤的疗效和安全性

目的：评价口服携带HPV16 E7 shRNA和IL-12基因的重组短双歧杆菌在小鼠体内抗宫颈癌移植瘤的效果。方法：将p MG36e-E7 shRNA、pMG36e-mIL-12D质粒分别转化短双歧杆菌,经筛选鉴定并扩增获得携带HPV16 E7 shRNA和IL-12基因的重组短双歧杆菌。通过小鼠皮下宫颈癌细胞移植建立荷瘤小鼠模型。口服重组短双歧杆菌1、7 d后,检测小鼠主要器官（心、肝、脾、肺、肾）和肿瘤组织匀浆液或血清在PYG培养基中形成的菌落数量,评价短双歧杆菌的肿瘤靶向性,以小鼠体内肿瘤生长曲线评估重组短双歧杆菌的抗肿瘤效果,通过主要器官切片H-E染色和检测荷瘤小鼠血清相关细胞因子水平评价口服重组短双歧杆菌的安全性。结果：成功制备重组短双歧杆菌和宫颈癌TC-1细胞移植瘤小鼠。7 d后,移植瘤组织匀浆液和血清的菌落数量证实短双歧杆菌具有靶向体内瘤组织的定殖能力,口服重组短双歧杆菌明显抑制荷瘤小鼠的肿瘤生长（P<0.05或P<0.01）,但联合使用携带HPV16 E7 shRNA和IL-12基因的重组双歧杆菌的肿瘤抑制率与单独使用的并无显著差异,治疗后未见对荷瘤小鼠主要...     

HPV-16 E6E7抗原表位嵌合体DNA疫苗黏膜免疫抑制宫颈癌的效果研究

目的 评价泛素及热休克蛋白70(HSP 70)C融合人乳头瘤病毒(HPV)16型E6E7表位嵌合体DNA疫苗鼻内黏膜免疫对宫颈癌移植瘤的预防和治疗效果。方法 建立TC-1小鼠肿瘤模型,以壳聚糖为发送载体,通过滴鼻免疫给药免疫C57BL/6小鼠。MTT法和淋巴毒性T细胞(CTL)反应检测小鼠脾脏T淋巴细胞增殖、流式细胞术检测细胞因子表达水平、肿瘤生长曲线和荷瘤小鼠存活时间评价壳聚糖包裹的HPV-16 E6E7嵌合体DNA疫苗鼻内黏膜免疫后对HPV-16型相关宫颈癌移植瘤的预防和治疗效果。结果 与对照组pcD-UH相比,实验组pcD-UE和pcD-UEH均具有显著的CTL反应,延缓HPV-16型相关宫颈癌移植瘤生长,但对已生成肿瘤无影响。鼻内黏膜途径发送壳聚糖包裹HPV-16 E6E7抗原表位嵌合体DNA疫苗仅能产生较弱的细胞免疫应答。结论 HPV-16 E6E7抗原表位嵌合体DNA疫苗通过鼻腔免疫,具有一定的肿瘤治疗和显著的肿瘤预防效果,为新型HPV疫苗的研制奠定了基础。     

中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞吞噬体成熟及其功能研究进展

吞噬体经过早期内体、晚期内体和溶酶体融合的变化,最终生成能降解抗原或杀死病原微生物的过程称为吞噬体成熟。吞噬体在不同免疫细胞中成熟后的功能差异,导致其对抗原摄取后的加工呈现不同的特征。通过比较中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞3种免疫细胞摄取抗原后的吞噬体功能差异,发现免疫细胞抗原降解能力与抗原提呈能力相反,三者中树突状...     

草原兔尾鼠卵透明带3基因重组腺病毒载体的构建及表达

目的:探索制备免疫不育疫苗的新途径,获得草原兔尾鼠卵透明带3(LZP3)重组腺病毒减毒活疫苗。方法:将LZP3基因亚克隆到穿梭质粒pShuttle-CMV上,采用细菌内同源重组"两步转化法"构建携带LZP3基因的重组腺病毒载体。获得的重组腺病毒载体线性化后转染HEK293细胞,包装成病毒颗粒。PCR鉴定重组腺病毒,继而用鉴定正确的重组腺病毒感染HeLa细胞,并以RT-PCR、Western blot检测LZP3的转录和表达。结果:成功构建了携带LZP3基因的重组腺病毒pAd-LZP3载体,其转染293细胞后包装出重组病毒,PCR证实LZP3基因已整合至腺病毒基因组中,病毒的滴度可达1.2×1010pfu/L。RT-PCR和Western blot检测表明RAd-LZP3感染的HeLa细胞中LZP3基因能够有效转录和表达。结论:制备的RAd-LZP3可成功表达LZP3基因,为后续开展RAd-LZP3免疫动物的研究奠定了基础。     

HSP70C融合草原兔尾鼠卵透明带3对小鼠抗生育的研究

目的:探讨分枝杆菌热休克蛋白(HSP70)对草原兔尾鼠卵透明带3(LZP3)免疫不育效果的增强作用.方法:将HSP70全长和C端分别与LZP3融合构建pcD-L-HSP70和pcD-L-HSP70C重组质粒,同时与具有免疫不育功能的pcD-L和pcD-ACLC一起分别免疫NIH小鼠,分别检测重组质粒在机体真核细胞中的表达情况、T细胞增殖及体液免疫水平、抗生育效果、卵巢的病理变化和免疫荧光定位.结果:LZP3构建的重组质粒均能在小鼠肝脏中表达;免疫后能刺激机体T细胞增殖,尤其是pcD-ACLC和 pcD-L-HSP70C免疫组(P<0.01);同时激发机体产生特异性抗体(P<0.05);除pcD-L-HSP70免疫组外其他3种重组质粒均具有抗生育效果(P<0.05),且 pcD-ACLC和pcD-L-HSP70C极明显地降低了小鼠平均窝仔数(P<0.01)且未引发机体产生卵巢炎;直接免疫荧光结果表明在绿色激发光下小鼠卵母细胞的卵透明带均能发出绿色荧光.结论:与pcD-L-HSP70免疫相比,pcD-L-HSP70C能明显地降低小鼠平均窝仔数,这表明分枝杆菌热休克蛋白HSP70C端对增强LZP3免疫不育效果具有明显的基因佐剂功效.     

NF-κB在压力调控BMSCs/PRF修复兔髁突软骨缺损中的作用研究

目的:探讨NF-κB信号通路在压力调控BMSCs/PRF双膜结构修复兔髁突软骨缺损中的作用。方法:取3~4月龄雄性新西兰兔30只,分离、培养骨髓间充质干细胞并制备成细胞膜片,抽取自体兔动脉血制备PRF,将二者复合制备BMSCs/PRF双膜结构。在所有实验动物双侧髁突作直径3 mm的缺损,制备髁突软骨缺损模型;将实验动物随机分为5组(n=6),A组:即空白对照组,缺损处不充填;B组:双膜结构充填缺损;C组:压力预调双膜结构后充填缺损;D组:NF-κB抑制剂(PDTC)预处理双膜结构后充填缺损;E组:压力预调加抑制剂预处理双膜结构充填缺损。分别于术后2、4、8周取材,HE染色观察缺损修复情况,Real-time PCR方法检测I-κB、P-65和成软骨相关基因Aggrecan、Sox-9的表达水平,并进行统计分析。结果:C组新生髁突软骨组织中NF-κB各信号分子及成软骨相关基因的表达水平均明显高于相同时间取材的其他各组(P<0.05),其缺损修复的效果也最好;D组、E组各时间点的NF-κB信号通路相关信号分子及成软骨相关基因表达水平均明显低于A、B、C组(P<0.05)。结论:BMSCs/PRF双膜结构能明显促进髁突软骨缺损的修复,以压力预调的双膜结构修复效果尤为显著;NF-κB参与了体内压力促双膜结构合成软骨的过程。