白血病患者异基因造血干细胞移植后T细胞免疫重建的研究

目的通过分析TCR Vβ基因片段选择性扩增,了解白血病患者异基因外周血干细胞移植后T淋巴细胞的免疫重建及其在移植物抗宿主病(GVHD)患者中的表达特点.方法采用RT-PCR扩增10例移植后患者外周血的单个核细胞的TCR Vβ 24个基因片段,分析其TCR Vβ基因的表达情况,GVHD患者的PCR产物进一步经基因扫描分析确定T细胞克隆性.结果经24个Vβ引物所分别进行的RT-PCR检测TCR Vβ各亚家族基因的表达情况,发现 10例病人外周血与正常人表达24个Vβ亚家族有明显的不同,病人的部分Vβ亚家族T细胞仍未能重建,仅表达5～22个亚家族基因;9例GVHD患者外周血仅表达2～8个TCR Vβ亚家族,其中7例均表达Vβ3.对6例GVHD患者的基因扫描显示,均存在克隆性T细胞生长.结论移植后病人外周血淋巴细胞TCR Vβ基因片段部分受抑制,部分基因片段呈选择性扩增.GVHD患者有Vβ3和Vβ8基因的优势表达,并有克隆性T细胞生成.     

CML患者CD4+和CD8+T细胞的TCR Vβ基因谱系和克隆性分析

目的：了解慢性粒细胞白血病慢性期（CML-CP）患者外周血CD4^＋和CD8^＋T细胞中TCR Vβ亚家族T细胞的基因表达和克隆性.方法：利用RT-PCR分别扩增19例CML-CP患者外周血单个核细胞（PBMCs）、CD4^＋和CD8^＋细胞TCR Vβ亚家族基因的CDR3,阳性产物进一步经基因扫描分析其克隆性.结果：CML患者外周血CD4^＋和CD8^＋细胞分别表达部分（1～21个）Vβ亚家族,均以Vβ13的表达率最高,其次为Vβ9,多数患者的一些Vβ亚家族T细胞呈克隆性增殖,主要出现于CD8^＋细胞中,分别以Vβ21（CD4^＋）和Vβ11（CD8^＋）亚家族的克隆性增殖多见.结论：CML患者外周血CD4^＋和CD8^＋细胞的TCR Vβ谱系均存在限制性分布,患者存在的克隆性增殖CD4^＋和CD8^＋T细胞可能与宿主抗CML抗原反应有关,它们可能在抗CML效应中起主要作用.     

CD3ζ链基因在脐带血T细胞及其CD4+和CD8+T细胞亚群中的表达特点

目的 了解脐带血T细胞及其CD4 和CD8 T细胞亚群的信号传导分子CD3ζ基因的表达特点.方法 采用SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR和相对定量分析法检测60例脐带血单个核细胞和12例纯化脐带血CD4 及CD8 T细胞的CD3ζ基因的表达情况,以β2微球蛋白基因(β2M)作为内参,采用相对定量公式:2-△Ct×100%,计算CD3ζ基因相对mRNA表达量,60例健康成人作为对照.并根据荧光定量PCR熔解曲线特点和序列分析了解CD3ζ基因突变情况.结果 全部脐带血和健康成人外周血单个核细胞均表达CD3ζ基因,不同个体CD3ζ基因表达量有所差异,脐带血T细胞CD3ζ基因相对mRNA表达量为6.7%±5.56%,CD4 和CD8 T细胞的CD3ζ基因相对mRNA表达量分别为6.74%±2.0%和6.88%±1.76%,三者CD3ζ基因表达量均明显高于健康成人(P=0.000,P=0.034,P=0.000).序列分析结果显示尚未发现国外文献所报道的ζ链剪接异构体.结论 本研究率先报道了脐带血T细胞及其CD4 和CD8 T细胞亚群的CD3ζ基因mRNA的表达水平,为进一步了解脐带血T细胞免疫学特点提供新的基础资料.     

超抗原SEA联合PML-RARα对外周血T细胞TCR Vβ亚家族基因表达的影响

目的探讨超抗原SEA联合PML-RARα多肽对外周血T细胞TCR邯亚家族基因表达的影响。方法分别将SEA、PML-RARα多肽以及SEA联合PML-RARα多肽与正常人外周血单个核细胞共同培养，20d后收集增殖细胞，利用RT-PCR及基因扫描技术分析诱导后增殖T细胞TCR Vβ亚家族的利用和克隆性增殖的特点。结果单纯SEA诱导后，T细胞表达了11个TCR Vβ亚家族，且仍为多克隆增殖。单纯PML-RARα多肽诱导后，T细胞限制性表达8个Vβ亚家族，其中Vβ13、Vβ14表现出寡克隆或寡克隆趋势。PML-RARα多肽联合SEA共同诱导，其T细胞表达TCR Vβ亚家族依然呈明显的限制性，且Vβ13、Vβ 14亚家族呈寡克隆、双克隆及寡克隆趋势。结论SEA能协同PML-RARα多肽诱导的T细胞克隆性活化与增殖。     

肺癌组织培养液和病人血清对自身T细胞集落形成能力的影响

本文观察了10例肺癌病人围术期的肺癌组织、正常肺组织培养液和血清对自身外周血T细胞集落形成能力的影响,并以14例正常人的血清作为对照。结果显示:肺癌人病在去肿瘤负荷前T细胞集落产率为160.73±124.02/10~5,故低于正常人的397.81±133.89/10~5(P<0.001),也低于去肿瘤负荷后的(P<0.001)306.53±79.86/10~5(P<0.001)。术前病人的血清对T细胞集落的抑制率为46.97±21.42%,术后则下降至27.63±23.25%(P<0.01)。加进肺癌组织培养液时,病人的T细胞集落产率为224.83±104.05/10~5,正常肺组织培养液则为323.12±125.27/10~5(P<0.001),肺癌组织培养液和病人血清两者对T细胞集落产率的抑制性呈正相关关系(r=0.817,P<0.005)。本研究结果认为,肺癌组织能产生细胞免疫抑制物质进入血循环,导致病人T细胞集落形成能力明显下降。手术根治性切除肺癌组织,能有效地解除T细胞集落形成能力受抑制的情况。     

脐带血和成人外周血TCR Vγ和Vδ亚家族的分布和克隆性研究

目的探讨脐带血和健康成人外周血TCR Vγ和Vδ基因谱系的分布情况及克隆性特点。方法利用RT-PCR法检测16例脐带血和10例健康成人外周血单个核细胞TCRVγ(Ⅰ～Ⅲ)和Vδ(1～8)各亚家族的表达,了解各亚家族的分布和利用情况;阳性的PCR产物进一步经荧光素标记和基因扫描分析其CDR3长度,了解T细胞的克隆性。2例成人胸腺组织作为对照。结果脐带血T细胞的Vγ基因表达主要集中在VγⅠ和VγⅡ,而Vδ基因则平均表达(4.63±1.03)个亚家族,主要集中在Vδ1、2、3、8中表达。健康成人外周血T细胞除了1例不表达VγⅢ之外,其余均表达全部Vγ基因,而在Vδ基因中则平均表达(3.6±0.52)个亚家族,并以Vδ1、2和3为多见,Vδ4和Vδ5未能在外周血中检测到,而Vδ5和Vδ8的表达则明显低于脐带血(P=0.009,P=0.001);2例成人胸腺组织表达除Vδ4和Vδ6之外的其他Vγ和Vδ亚家族。基因扫描显示16例脐带血中有1例在VγⅠ和5例分别在Vδ2、Vδ4和Vδ6中出现寡克隆性,10例成人外周血中有9例在不同亚家族中出现克隆性T细胞,其余均呈多克隆性。结论脐带血TCRVγ和Vδ亚家族T细胞和健康成人外...     

G-CSF和GM-CSF对髓系白血病细胞增殖的影响

目的 了解粒细胞集落刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）和粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）对髓系白血病细胞增殖的影响。方法 采用甲基纤维素半固体培养法培养白血病细胞集落（ＣＦＵ－Ｌ）,观察Ｇ－ＣＳＦ和ＧＭ－ＣＳＦ对１１例ＡＭＬ和ＣＭＬ患者外周血ＣＦＵ－Ｌ形成的影响。结果 ＣＭ－ＣＳＦ对ＣＦＵ－Ｌ的促进作用明显高于Ｇ－ＣＳＦ（Ｐ＝０．０１２）,而Ｇ－ＣＳＦ对ＣＦＵ－Ｌ形成影响与对照组没有显著性差别（Ｐ＝０．４９５）。结论 Ｇ－ＣＳＦ对髓系白血病细胞体外增殖无明显影响,作为髓系白血病大剂量化疗的支持治疗可能更为安全。     

骨髓间充质干细胞治疗慢性移植物抗宿主病后患者外周血T细胞受体Vβ亚家族谱系变化研究

 目的　研究输注骨髓间充质干细胞（MSC）治疗慢性移植物抗宿主病（cGVHD）后患者外周血T细胞受体（TCR）Vβ基因谱系变化及克隆性增殖情况。方法　1例经异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）后发生cGVHD的患者接受MSC治疗,分别于第1次输注MSC后第1、5天及第2次输注MSC后第1、10、20天采集外周血,同时将输注的MSC作为对照,利用反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法扩增单个核细胞中24个TCR Vβ基因的互补决定区3（CDR3）,PCR 产物经荧光标记和基因扫描分析CDR3长度,从而确定T细胞的克隆性。结果　患者输注的MSC不表达全部TCR Vβ亚家族,第1次输注MSC后第1天也未发现TCR Vβ亚家族的表达,随后的时间点分别出现了3、10、14、10个Vβ亚家族的克隆增殖T细胞,增殖形式以寡克隆、多克隆为主;临床判断cGVHD表现减轻。结论　MSC对allo-HSCT后患者免疫功能的恢复有一定作用,并能减轻cGVHD效应;TCR Vβ亚家族谱系分析提示有部分优势表达。     

AML-M2a诱导TCR Vβ T细胞的克隆性增殖和细胞毒作用

目的:了解急性髓性白血病(AML)M2a细胞诱导的体外增殖T细胞的特异性杀伤作用和克隆性增殖情况.方法:利用肿瘤细胞-T淋巴细胞混合培养方法(MLTC),分别收集3例经AML-M2a细胞体外诱导不同扩增时间的健康人T细胞,利用LDH释放方法分析其特异性细胞毒作用,同时利用RT-PCR和基因扫描方法分析经AML-M2a细胞诱导前后T细胞的24个TCR Vβ亚家族基因的表达和克隆性情况.结果:在培养第12天和第21天时,1例AML-M2a细胞诱导的3例健康人T细胞对该诱导细胞的平均杀伤率分别为39.88±7.79%和62.14±9.79%,而对AML-M2a患者和健康人外周血T细胞均无杀伤作用.TCR Vβ谱系分析发现诱导后3例健康人T细胞均出现Vβ16的克隆性增殖.结论:AML-M2a细胞可诱导健康人T细胞成为具有克隆性增殖的特异性CTL,并以Vβ16的克隆性增殖为主.     

实时定量PCR分析B-ALL病人TCRζ链表达特点

分析T细胞信号传导分子TCRζ链基因在B细胞-急性淋巴细胞白血病(B-ALL)病人外周血中的表达水平.方法:采用SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR和相对定量检测15例初发B-ALL、5例完全缓解期(CR)患者和30例正常人外周血的单个核细胞的TCRζ链表达情况,以β2微球蛋白基因(β2M)作为内参,根据相对定量公式(2-△△Ct)分别计算B-ALL初发患者、CR期患者与正常人TCRζ链表达差异倍数等.结果:根据相对定量公式分析显示:与正常人相比,B-ALL初发患者外周血TCRζ链表达存在3种情况,即不表达(20%)、表达下降(53%)和表达上升(27%).TCRζ链表达水平在所有初发B-ALL病人均低于CR期病人.结论:本研究首先报道B-ALL病人中TCRRζ链表达水平的变化特点,TCRζ链基因表达水平以降低为主,可能与T细胞免疫缺陷有一定关系.