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目的克隆编码大鼠α-突触核蛋白的cDNA,探讨α-突触核蛋白基因在原核细胞中的表达过程并制备基因重组型α-突触核蛋白。方法设计合成含适当酶切位点的DNA片段作为引物,采用RT-PCR法从Wistar大鼠脑总RNA中扩增编码α-突触核蛋白的cDNA并亚克隆至原核表达质粒pGEX-4T-1,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),使其表达以谷胱甘肽S转移酶(glutathione-S-transferase,GST)为标签的融合蛋白质。用凝血酶定点分解融合蛋白,再用谷胱甘肽-琼脂糖4B和Superdex S200纯化基因重组型α-突触核蛋白。结果核酸序列测定表明克隆的cDNA含420 bp编码140个氨基酸,重组质粒pGEX-raSYN在原核细胞中表达为可溶性组分并受IPTG诱导,纯化的目的蛋白质在SDS-PAGE上表现为单一条带,推测其相对分子质量约为18 000。每升细菌培养液可纯化目的蛋白质3 mg。Western blot分析结果表明纯化的目的蛋白质可以被抗α-突触核蛋白识别。结论大鼠α-突触核蛋白基因在原核细胞高效表达,可制备高纯度基因重组型大鼠α-突触核蛋白。 相似文献
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目的研究外周神经损伤后背根神经节细胞中Ephrin B1及其相关受体的表达变化。方法建立一侧坐骨神经夹伤的大鼠动物模型,通过免疫荧光组织化学方法检测受损侧背根神经节细胞中Ephrin B1及其相关受体Eph B1、Eph B2、Eph B3和Eph A4、RYK等的表达,并分析阳性细胞数和不同大小阳性细胞的构成比例。结果外周坐骨神经受损侧背根神经节细胞中Ephrin B1的表达明显减弱,而Eph B1、Eph B2、Eph B3和Eph A4受体的表达无明显变化,但RYK受体的表达则明显加强。结论Ephrin B1和RYK受体在一侧外周坐骨神经夹伤后的大鼠背根神经节细胞中表达的变化,说明它很有可能参与了损伤后的功能活动。 相似文献
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为了探讨14-3-3ζ蛋白在中枢神经系统内的分布,本文采用纯化的基因重组型14-3-3ζ蛋白免疫Balb/c小鼠,用杂交瘤技术制备抗14-3-3ζ蛋白单克隆抗体;Western blot及免疫组织化学法鉴定抗体。结果显示:制备的单克隆抗体能特异性识别基因重组14-3-3ζ蛋白和大鼠脑匀浆32kD蛋白。免疫组化染色结果显示,14-3-3ζ蛋白在大鼠中枢神经系统广泛分布,在皮层、海马、杏仁核和基底前脑的免疫阳性染色较强,免疫阳性产物位于神经元胞浆内。本研究结果提示,14-3-3ζ蛋白可能具有多样化的生理功能。 相似文献
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目的建立小鼠脑组织中腺苷酸含量测定的高效液相色谱(high performance liquid chromatogram,HPLC)-可变波长检测法。方法应用酸沉淀蛋白、Agilent1200高效液相色谱系统、Supelco Discovery C18(150 mm×4.6 mm,5μm)反相色谱柱及相同填充材料的预柱,对小鼠脑组织样品中腺苷酸进行分离分析,波长为254 nm,流动相为30 mmol/L K2HPO4-KH2PO4(含5%甲醇),pH5.85,流速为1.0 mL/min,进样体积为20μL,柱温为30℃。结果腺苷酸ATP、ADP及AMP在10~100 mg/L范围,线性关系良好,线性方程为ATP:A=28.924C+14.144,γ=0.999 90;ADP:A=31.504C-12.608,γ=0.999 92;AMP:A=46.539C-5.255,γ=0.999 95。平均回收率为95.3%~103.2%;日内和日间相对标准差(RSD)分别为1.14%~1.75%、2.45%~3.97%。结论高效液相色谱-可变波长检测法可以简便、准确、有效地测定急性重复低氧小鼠脑组织中ATP、ADP和AMP的含量。 相似文献
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1960年2月~1985年7月,我用自拟绿石丸治疗类风湿关节炎40例。病程最短1年,最长42年。治疗前均经地市以上医院确诊为类风湿关节炎。【方药组成与用法】绿豆200克,肉桂25克,陈石灰适量。将绿豆、肉桂研末,先用绿豆末与凉水搅拌匀,置火上边煮边搅成糊状后 相似文献
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目的:探讨Mr45000葡萄糖运输体1在脑实质细胞中的分布。方法:实验于2004-08/09在首都医科大学宣武医院低氧医学研究所神经生物研究实验室完成。选择SD成年二级大鼠2只,雄性,体质量约250g。1只大鼠脑制成匀浆后,验证葡萄糖运输体1C-末端的部分合成肽免疫家兔制成的抗血清对Mr45000葡萄糖运输体1的特异性应用免疫印迹试验。另1只雄性大鼠在深麻醉下,取脑制成20μm切片,观察Mr45000葡萄糖运输体1在大鼠脑实质细胞中的定位应用抗生素蛋白—生物素复合体染色法和免疫电镜法。结果:①葡萄糖运输体1C-末端的部分合成肽免疫家兔制成的抗血清是一种高效价的对Mr45000葡萄糖运输体1特异的抗体。②Mr45000葡萄糖运输体1蛋白在正常脑的胶质细胞以及皮质以外某些特定部位的神经元中表达。③Mr45000葡萄糖运输体1阳性胶质细胞多数是少突胶质细胞,少数是星形胶质细胞。结论:在适当延长抗体和脑组织切片反应时间的基础上,Mr45000葡萄糖运输体1在星形胶质细胞、少突胶质细胞和某些特定部位的神经元中均有表达。 相似文献
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揭示α-突触核蛋白与帕金森病的关系:α-突触核蛋白单克隆抗体的研究 总被引:3,自引:2,他引:3
目的:α-突触核蛋白(α-Synuclein,α-Syn)是与帕金森病的发病密切相关的蛋白质。关于这种蛋白质在脑内神经元的亚细胞分布迄今尚无定论。制备α-Syn抗体探讨α-Syn在亚细胞的定位。方法:实验于2004—01/05在北京老年医学研究所神经生物研究室完成。采用重组的人α-Syn免疫小鼠,并将其脾细胞与骨髓瘤融合制备出杂交瘤,利用免疫组化和Western blot法筛选阳性克隆,获得一特异性抗α-Syn单克隆抗体。结果:噬菌体多肽展示分析表明,该抗体识别人α-Syn C-末端的一段特异序列,但该序列与大鼠和小鼠的相应序列差一个氨基酸。免疫印记分析表明,该抗体能够检测人、大鼠与小鼠脑组织中的α-Syn。用该抗体进行免疫组化染色结果显示,α-Syn免疫阳性物质主要存在于神经元末梢与核中。结论:所制备的单克隆抗体对α-Syn具有特异性,可用于人、大鼠和小鼠的α-Syn研究。 相似文献
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α-突触核蛋白对MES23.5多巴胺能神经细胞的促增殖作用 总被引:1,自引:0,他引:1
目的:分析外源性野生型α-突触核蛋白对多巴胺能神经细胞增殖的影响及其分子机制。
方法:实验于2005—04/11在北京老年病研究所神经生物室完成。向MES23.5多巴胺能神经细胞的培养基中加入重组人野生型α-突触核蛋白,孵育48h后用细胞免疫荧光标记法和Western blot分析法检测α-突触核蛋白在细胞内的分布,用MTS法绘制生长曲线观察细胞增殖率,用基因芯片分技术观察α-突触核蛋白处理细胞的基因表达谱变化。
结果:重组人野生型α-突触核蛋白可以进入MES23.5多巴胺能神经细胞,并促进其增殖。在α-突触核蛋白处理的细胞。有22个基因的表达发生明显变化,有3个基因与内吞相关,5个与转录有关,3个与蛋白质合成有关,3个与细胞生长和增殖有关,4个与分化有关,1个与增殖及分化均有关,2个与小泡生成和神经递质释放有关,1个与生理周期有关。
结论:外源性α-突触核蛋白可能通过内吞作用进入MES23.5多巴胺能神经细胞。从而促进其增殖;α-突触核蛋白的促细胞增殖作用可能与其影响某些基因表达有关。 相似文献
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目的:构建表达人早老素1N端部分肽段的基因重组质粒。
方法:实验于2004-12/2005一01在北京老年医学研究所神经生物研究室完成。参照人早老素1mRNA结构设计合成含适当酶切位点的聚合酶链反应引物,从质粒pBS—Presenilins1扩增其5’端390bp的cDNA片段,插人质粒pGEX-4T-1,转化人大肠杆菌BL21(DE3),以异丙基-B-D-硫代半乳糖苷诱导表达,使其在大肠杆菌中表达以谷胱甘肽S转移酶为标签的融合蛋白质。用凝血酶定点分解融合蛋白,并应用亲和层析法纯化早老素1N130肽。
结果:聚合酶链反应扩增产物约400bp,核酸序列分析结果显示,扩增产物为393bp编码130个氨基酸。重组质粒在原核细胞中表达受异丙基-B—D-硫代半乳糖苷诱导呈时间依赖性递增。纯化的目的蛋白在聚丙烯酰胺凝胶电泳上表现为单一条带,其表观相对分子质量为13000。每升菌液可收获目的蛋白4.5mg。
结论:构建人早老素1N端部分肽段的基因重组质粒,制备了基因重组型早老素1N130肽,并确认其亲水特征。 相似文献