脂质代谢相关新基因与肝肿瘤发生研究进展

研究发现,恶性肿瘤存在基因异常和代谢异常,后者表现在能量代谢的异常较突出,而作为肿瘤能量来源底物的脂肪酸代谢研究并不多见。本文讨论了与脂质代谢相关的新基因,如ALDOC、TUBB5、ANXA2、FABP4、ApoA1和AOP1,CIDE家族蛋白（Cidea、Cideb、Fsp27）,在产生癌症相关性恶病质中起关键作用的脂肪甘油三酯脂肪酶（ATGL）和激素敏感性脂肪酶（HSL）,长链酰基辅酶A脱氢酶（ACADL）,SCD1、FASN或ACC1等。由于肿瘤细胞与正常细胞在能量代谢上存在明显的差异,因此根据这种区别以能量代谢途径上的某个分子作为肿瘤治疗的靶点是完全有可能的。     

RPS4Y1蛋白在前列腺癌组织中的表达及意义

目的 探讨RPS4Y1蛋白在前列腺癌组织中的表达及意义.方法 利用Real-time PCR、RT-PCR和免疫组织化学方法检测RPS4Y1在不同细胞系以及前列腺癌组织中的表达.结果 RPS4Y1的表达在C4-2中比LNCaP中下调(137.19±13.64)倍;RPS4Y1在LNCaP、C4-2、C4-2B中随着恶性程度的增加,其表达随之降低,在骨转移前列腺癌细胞系中未见表达,而脑转移的前列腺癌细胞系DU145中有较高表达,在MCF-7、HepG2、Hela、PC12、293T等细胞系中未检测到RPS4Y1的表达,特异性较好;RPS4Y1胞浆阳性,表达与恶性程度呈负相关,与表达谱结果一致.结论 RPS4Y1蛋白可作为前列腺癌进展诊断的候选分子标志物.     

可溶化人羊膜液、绒毛膜液和全羊膜液对间充质干细胞增殖的影响

目的探讨可溶化人羊膜液(solubilized-amnion product,SAP)、绒毛膜液(solubilized-chorial product,SCP)、全羊膜液(amniotic fluid,AF)对羊膜间充质干细胞(human amniotic mesenchymal stem cells,h AMSC)的增殖影响。方法用物理化学方法提取可溶化羊膜液、绒毛膜液、全羊膜液,用CCK-8试剂盒检测不同浓度的羊膜液、绒毛膜液、全羊膜液对h AMSC的增殖作用。剥去38~40周孕妇剖腹产术后羊膜,用消化酶消化后制备h AMSC。结果 h AMSC在可溶化羊膜液、绒毛膜液中生长良好,细胞增殖明显大于对照组,且培养液中的浓度具有显著依存性。全羊膜液培养前期增殖效果不明显,但培养4 d后出现浓度依存性的细胞增殖效果。这些生物材料对Hep G2无明显效果。结论可溶化人羊膜液、绒毛膜液、全羊膜液对干细胞具有促进增殖生长作用,有望成为干细胞研究与再生医疗领域中的新型生物材料。     

内质网应激在四氯化碳致大鼠急性肝损伤中的作用探讨

目的研究内质网应激在四氯化碳诱导的大鼠急性肝损伤中的变化规律和作用机制。方法采用四氯化碳制备大鼠急性肝损伤模型，动态测定大鼠肝脏GRP78蛋白和caspase 12酶原表达情况，测定大鼠血清ALT、AST水平、肝组织SOD活性、MDA浓度和caspase 3活性变化；采用HE染色和TUNEL法观察肝组织病理形态学和肝细胞凋亡变化。结果四氯化碳染毒后大鼠肝脏GRP78蛋白表达显著增加，caspase 12酶原表达相应减少，呈一定时间依赖方式。大鼠染毒后出现血清ALT、AST水平以及组织MDA含量显著升高，SOD活性明显下降，与对照组有显著性差异（P〈0．01）；染毒后大鼠肝组织caspase 3活性亦显著升高，病理学及TUNEL法检测结果均显示肝脏有严重损伤，大量肝细胞发生凋亡。结论四氯化碳诱导大鼠肝损伤时GRP78和caspase 12的表达变化表明发生了内质网应激反应，其变化趋势和大鼠肝细胞凋亡、病理损伤一致，这一结果提示内质网应激介导的肝细胞凋亡参与了大鼠肝损伤。     

人羊膜间充质干细胞的生物学特性鉴定

目的分离提纯的人羊膜间充质干细胞的生物学特性鉴定。方法剥去38～40周孕妇剖腹产术后羊膜,用消化酶消化后制备人羊膜间充质细胞（hAMCs）悬浮液。利用流式细胞分选技术从hAMCs中分离提纯干细胞（hAMC-SP细胞）,并对于细胞抗原进行鉴定。结果从hAMCs中分离的hAMC-SP细胞,约占AMCs总数的0．3％。传代培养4～10代后的hAMC-SP细胞表达Nestin、Vimentin、整合素家属成员（CD49b、CD49c、CD49d、CD49e）、CD9、CD13、CD19、CD29、CD44、CD46、CD51、CD59、CD166及干细胞相关的Oct-3／4抗原。HLA-ABC、TRA-1-81及SSEA-4为弱表达;相反CD34、CD45、CD117、CD56、CD90、CD105、CD106、CD133、Fit-1、Musashi 1及HLA-DR无阳性结果,同样TRA-1-60及SSEA-3也表达阴性。体外转化实验表示hAMC-SP细胞在琼脂糖培养基上不形成细胞集落,但阳性对照组的HepG2形成多数细胞集落。结论hAMC-SP细胞表面标记符合骨髓及脂肪间充质等来源的干细胞特点;hAMC-SP细胞迅速而稳定扩增,无致瘤性。由于来源充足,hAMC-SP细胞在消除HLA-ABC阳性细胞亚群下,同种异体移植在内的广泛的再生医学领域中能成为理想的细胞来源。     

四氯化碳诱导大鼠慢性肝损伤模型方法的探讨

目的研究大鼠慢性肝损伤模型的建立方法。方法以20％和50％四氯化碳植物油溶液给SD大鼠腹腔注射8周,制备大鼠慢性肝损伤模型,观察大鼠饮食、体重和血清ALT、AST水平的变化,采用TUNEL法观察肝细胞凋亡情况,以评价成模效果。结果实验组大鼠饮食量降低,体重增加缓慢。实验组ALT和AST分别为204．1±35．7U／L和307．5±54．1U／L,而对照组分别27．6±3．1U／L和50．5±9．0U／L。实验组动物出现肝细胞变性、凋亡、坏死及再生等病变。大剂量四氯化碳容易弓l起肝纤维化。结论应用20％～50％四氯化碳溶液在1．5ml·kg^-1 bw剂量下腹腔注射可诱导大鼠典型的肝损伤模型,病变稳定,操作简便,可供实验研究应用。     

大鼠慢加急性肝衰竭模型建立的方法探讨

目的研究大鼠慢加急性肝衰竭模型的建立方法。方法以50％四氯化碳植物油溶液腹腔注射,每3天1次,连续3个月。其中,第1个月剂量为1.5mL／kg体重,第2、3个月剂量为2mL／kg体重。3个月后将大鼠随机分为3组,分别腹腔注射2g／kg体重D-氨基半乳糖、100μg/kg体重脂多糖联合0.5g／kg体重D-氨基半乳糖和5mL／kg体重50％四氯化碳植物油溶液。通过观察大鼠饮食和体重变化,测定大鼠血清丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）和总胆红素（TBil）水平,以及观察大鼠肝组织病理形态改变来评价成模效果。结果大鼠腹腔注射四氯化碳植物油溶液3个月过程中,出现了不同程度的慢性肝损伤。其中,1个月后出现肝纤维化,2个月后表现为轻度肝硬化,3个月后出现明显肝硬化、腹水及黄疸症状。在前3个月的基础上再给予上述3种试剂后,短时间内诱导急性肝衰竭。结论四氯化碳腹腔注射3个月后大鼠出现明显肝硬化。在此基础上分别给予D-氨基半乳糖、脂多糖联合D-氨基半乳糖、四氯化碳,均可成功诱导肝硬化基础上的急性肝衰竭。     

氧化应激介导糖原合成酶激酶-3促进D-氨基半乳糖联合脂多糖诱导的急性肝衰竭肝损伤

目的探讨糖原合成酶激酶3(GSK3)在氧化应激促进D-氨基半乳糖联合脂多糖诱导小鼠急性肝衰竭肝损伤中的作用。方法以C57BL/6小鼠为研究对象,腹腔注射D-氨基半乳糖(D-Gal N)联合脂多糖(LPS)建立小鼠急性肝衰竭模型。氧化应激抑制剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)或GSK3特异性抑制剂SB216763分别对急性肝衰竭小鼠模型进行干预。检测小鼠血清转氨酶ALT、AST评价肝脏功能,检测肝脏组织中谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶活性(SOD)及丙二醛(MDA)水平评价氧化应激程度,免疫印迹方法检测肝脏组织p-GSK3、p-JNK蛋白表达。结果 D-Gal N/LPS诱导急性肝衰竭引起肝组织GSH和SOD水平降低,肝组织MDA水平上升。NAC干预改善急性肝衰竭损伤(血清ALT、AST水平明显下降),同时增加肝脏组织GSK3β的磷酸化水平(降低GSK3β的活性)。SB216763抑制GSK3β活性增加急性肝衰竭小鼠肝组织GSH和SOD含量,降低肝组织中MDA含量。GSK3β抑制下调肝脏中p-JNK的表达。结论 GSK3β是氧化应激促进急性肝衰竭损伤中的一种重要信号分子,抑制GSK3β活性,减轻氧化应激可以改善急性肝衰竭损伤。     

抑制糖原合成酶激酶3活性对Toll样受体4介导肝脏炎症反应的调节作用

目的 研究抑制糖原合成酶激酶3 β (GSK-3 β)活性对Toll样受体4介导的炎症反应的调节作用. 方法 以C57BL/6小鼠为研究对象,分别建立不同灌注时间的小鼠热缺血再灌注损伤模型以及通过腹腔注射脂多糖(LPS)建立小鼠肝脏炎症模型；通过小鼠的股骨分离出骨髓干细胞,经过分化培养获得骨髓来源的巨噬细胞,随后通过LPS激活TLR4配体引发炎症细胞模型.通过SB216763抑制GSK-3β活性,分别干预小鼠肝脏炎症模型和炎症细胞模型.通过Western blot检测肝脏丝裂原活化蛋白激酶的表达；实时定量PCR方法检测细胞炎症因子的基因表达.用SPSS13.0统计软件进行单因素方差分析,用LSD- f检验进行组间比较. 结果 在肝脏缺血再灌注过程中,丝裂原活化蛋白激酶(包括ERK、JNK和p38)的磷酸化水平在灌注1h后增加,ERK、JNK和p38的活性升高,但在4h后,这种活性激活消失,回归到起始水平.此外,LPS刺激巨噬细胞激活ERK、JNK在15 min被磷酸化而激活,p38蛋白在1h左右磷酸化而被激活.SB216763预处理一定程度上抑制了LPS刺激巨噬细胞的ERK、JNK和p38蛋白磷酸化的激活.无论是小鼠肝脏炎症模型还是炎症细胞模型,GSK-3 β活性抑制均促进了抗炎细胞因子白细胞介素10 (IL-10)的表达,而显著抑制了促炎细胞因子IL-12、肿瘤坏死因子(TNF)α,IL-6和IL-1β的基因表达.在对照组、炎症组及SB216763干预组小鼠炎症模型中炎症因子基因表达结果显示,IL-10相对表达量分别为0.21±0.08,0.83±0.21,1.76±0.67,F=3.16,P=0.027;IL-12相对表达量分别为0.11±0.05,0.85±0.11,0.43±0.10,F=2.67,P=0.038；TNFα相对表达量分别为0.052±0.012,8.11 ±0.98, 3.9±0.82,F=4.13,P=0.016; IL-1 β相对表达量分别为0.12±0.07,2.51±0.62,1.28±0.33,F=2.22,P=0.030;IL-6相对表达量分别为0.22±0.08,6.37±0.81,2.11±0.63,F=3.21,P=0.024.结论 抑制GSK-3 β活性选择性地调节肝脏中枯否细胞抗炎和促炎因子的表达从而引起肝脏缺血再灌注损伤的改善,随着促炎细胞因子被抑制,使得炎症反应所诱导的肝细胞凋亡也间接地受到有效控制.     

糖原合成酶激酶-3β在肝脏热缺血再灌注损伤中的作用及其干预

目的 研究细胞内信号分子糖原合成酶激酶-3 β在肝脏缺血再灌注损伤中的作用.方法 以C57BL/6小鼠为研究对象,夹住肝脏动脉和门静脉以阻断肝脏向头侧肝叶血供90 min,随后建立不同灌注时间的小鼠热缺血再灌注损伤模型.动物实验组包括:假手术组,缺血再灌注模型组,SB216763干预组(SB216763溶于二甲基亚砜,质量分数为0.025,腹腔注射,缺血前2 h给予).通过Western blot检测肝脏组织中糖原合成酶激酶-3 β磷酸化的表达;检测血清ALT及组织病理学观察肝脏组织的损伤情况,实时定量PCR检测细胞炎症因子的基因表达.多组样本均数的两两比较采用one-way ANOVA分析(方差齐者用LSD-t检验,方差不齐者用Games-Howell法),P<0.05为差异具有统计学意义.结果 Western blot检测结果显示,在缺血再灌注的90 min缺血过程中,糖原合成酶激酶-3 β被去磷酸化而活性显著激活.抑制糖原合成酶激酶-3 β活性显著改善了肝脏的功能:ALT明显下降[干预组对模型组:(2046±513)U/L对比(5809±1689)U/L,P=0.0153],肝脏的组织病理损伤明显改善,并显著抑制了肝脏的炎症反应:促进肝脏组织中抗炎细胞因子白细胞介素10(IL-10)的基因高表达,并同时抑制了促炎细胞因子IL-12、IL-1 β、肿瘤坏死因子α、IL-6的基因表达.结论 肝脏缺血再灌注损伤过程中,缺血提高了糖原合成酶激酶-3 α活性,促进了炎症反应的发生并导致了肝脏组织的损伤.因此,以糖原合成酶激酶-3 α为靶点进行干预,有可能为肝移植患者提供一种新的、有效的治疗方法来改善肝脏缺血再灌注损伤.

Abstract：

Objective To investigate the role of the key intracellular signaling molecule glycogen synthase kinase-3 beta in the mechanism of liver ischemia reperfusion (IR). Methods C57BL/6 mice were subjected to 90 min warm liver cephalad lobe ischemia, followed by various length of reperfusion. Experiment groups included sham control group, liver IRI model group and glycogen synthase kinase-3 beta inhibitor-treated group (SB216763 in DMSO, 25 g/kg, i.p, 2 hour prior to the onset of liver ischemia). The expression of glycogen synthase kinase-3 beta protein was analysed by Western blotting. The serum ALT levels were determined to reflect the function of liver. The affected liver lobes were harvested for histology analysis. The inflammatory gene expression was detected by Quantitative PCR. Results By western blot analysis, we found that ischemia itself activated glycogen synthase kinase-3 beta by a significant decrease of its phosphorylation. Glycogen synthase kinase-3 beta inhibitor SB216763-pretreatment ameliorated the liver damages significantly as compared to the controls (sALT: 2046 ±513 U/L vs 5809 ± 1689 U/L, P = 0.0153), and suppressed the gene expressions of IL-12, TNF α, IL-1 β and IL-6. Conclusions This study demonstrated that the ischemia process modulated liver innate immune activation via a GSK-3-dependent mechanism which favored the development of a pro-inflammation response and lead to liver tissue damages. GSK-3β may be a new therapeutic target to ameliorate liver IRI in transplant patients.