小鼠胚胎干细胞向肝细胞定向分化过程中NF-κB表达

目的了解小鼠胚胎肝脏发育的过程和体外干细胞向肝细胞定向分化与NF-κB表达的关系,探讨干细胞向肝细胞定向分化的分子机制。方法分离培养扩增小鼠原始生殖嵴细胞,向培养液中分别加入20μg/L的β-神经细胞生长因子(β-NGF)、0.5g/L新生鼠肝脏提取液和胎肝细胞上清液,体外诱导小鼠生殖嵴来源的胚胎干细胞(PGCs)向肝样细胞定向分化。观察细胞的形态学变化;免疫细胞荧光法检测肝样分化细胞内α1-抗胰蛋白酶(AAT)及NF-κB的表达,Real-Time PCR方法检测诱导分化过程中NF-κB mRNA的表达。免疫组化法检测胚胎发育11.5、14.5、18.5d的肝脏组织中NF-κB的表达。结果 PGCs培养液中加入β-NGF、新生鼠肝脏提取液和胎肝细胞上清液可见部分细胞变为圆形或卵圆形;诱导12d后,圆形或卵圆形细胞呈ATT阳性表达;在诱导分化过程中NF-κB的表达逐渐增强,伴随肝细胞的成熟而呈阳性表达并由胞质转入胞核。Real-Time PCR方法检测结果显示,在诱导分化过程中NF-κB的表达升高(t=50.229~75.344,P<0.01)。在胎肝发育过程中随肝原细胞向肝成熟细胞转化,肝细胞胞质中NF-κB的表达逐渐增强,并向细胞核内转移。结论 NF-κB在PGCs体外向肝细胞分化和体内肝发生过程中变化一致。     

CUGBP1在人肺腺癌组织和细胞中的表达

目的比较分析CUGBP1基因在人肺腺癌组织和细胞内表达的特点,及其CUGBP1表达水平与癌细胞增殖活性的关系。方法以人肺腺癌组织标本和人肺腺癌细胞株A549为研究对象,应用免疫组化、WesternBlot、RT—PCR方法检测人肺腺癌组织、细胞内CUGBP1蛋白和基因的表达,并分析其特点。结果CUGBP1基因主要在人肺腺癌组织的细胞核呈强阳性表达,在所有类型腺癌组织中80％以上的癌巢细胞CUGBPl基因呈阳性表达,阳性表达率明显高于正常对照组,差异有显著性（t=100．01,P＜0．001）。95％以上的A549细胞CUGBP1表达呈阳性,且CUGBP1表达量明显低于LPS组,差异有显著性（t=407．53,P＜0．001）。结论CUGBPl基因在人肺腺癌癌巢细胞和A549细胞的胞核内高表达;炎性刺激可增强人肺腺癌细胞株A549的增殖和CUGBPl基因表达;CUGBP1基因可能成为人肺腺癌的早期诊断和增殖状态判断的新指标。     

EGCG对A549细胞炎性反应模型UBC9表达的影响

 目的 观察泛素连接酶9(ubiquitin conjugating enzyme 9,UBC9)在表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate,EGCG)作用的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导A549细胞中的表达,探讨UBC9与EGCG抗炎性反应机制的相关性。方法 根据筛选结果随机分为对照组、EGCG组、LPS组、EGCG＋LPS组4个组,MTT检测不同浓度的EGCG(50～400 μg/ml)和LPS(10～50 μg/ml)对A549细胞增殖活性的影响,筛选最佳作用浓度,进一步通过免疫组化染色法、蛋白质印迹法和Realtime-PCR检测分析各处理组UBC9蛋白及其mRNA的相对表达量。结果 MTT显示,200 μg/ml的EGCG细胞增殖抑制作用最强(F=1618.18,P＜0.001),LPS 25μg/ml细胞增殖活性最明显(F=237.38,P＜0.001)。免疫组化与蛋白质印迹检测均显示,与对照组比较,EGCG下调A549细胞UBC9蛋白表达(P＜0.001),LPS则上调UBC9表达量(P＜0.001),与LPS组比较,EGCG＋LPS组UBC9蛋白表达明显降低(P＜0.001)。同样,Realtime-PCR显示,与对照组比较,EGCG组UBC9 mRNA表达下调(F=89.34,P＜0.001),LPS组UBC9 mRNA表达上调(F=225.00,P＜0.001),与LPS组比较,EGCG＋LPS组UBC9 mRNA的表达受到抑制,显著降低(F=625.00,P＜0.001)。结论 EGCG下调LPS刺激的炎性反应模型的UBC9的表达,其抗炎机制可能与抑制UBC9蛋白与mRNA表达有关。     

NF-κB和Ubc9在HGF和β-NGF诱导骨髓基质干细胞分化为肝细胞中的作用

目的探讨核因子κB(NF-κB)和泛蛋白连接酶(Ubc9)在肝细胞生长因子(HGF)和β-神经生长因子(β-NGF)诱导骨髓基质干细胞(BMSCs)向肝样细胞分化中的作用。方法取小鼠股骨骨髓,直接贴壁法分离纯化BMSCs,传代,取第3代BMSCs,分为HGF组(胎肝细胞加入30μg/L的HGF诱导14d)、β-NGF组(胎肝细胞加入50μg/L的β-NGF诱导14d)、阳性对照组(胎肝细胞培养12d)和阴性对照组(不加诱导剂的BMSCs)。显微镜下观察诱导不同时间各组细胞形态变化,应用免疫荧光法鉴定肝细胞特异表达蛋白α1-抗胰蛋白酶(AAT)表达,免疫荧光及Realtime-PCR方法检测诱导14d后细胞NF-κB、Ubc9蛋白和mRNA的表达。结果显微镜下观察显示,经过HGF与β-NGF诱导14d后部分细胞呈圆形或卵圆形,与阳性对照组细胞形态一致;免疫荧光结果显示,经HGF与β-NGF诱导14d后细胞胞质AAT均呈阳性表达,部分细胞胞质与胞核同时呈阳性表达。与阴性对照组比较,经HGF与β-NGF诱导后NF-κB和Ubc9主要在细胞胞质中呈阳性表达,荧光强度随细胞形态向肝细胞分化呈现逐渐增强趋势。Realtime-PCR结果显示,HGF组、β-NGF组NF-κB、Ubc9mRNA的表达均较阳性对照组增高,差异有显著性(F=2 272.6、866.4,P<0.01)。结论 HGF和β-NGF诱导BMSCs向肝细胞分化过程中NF-κB和Ubc9均呈阳性表达,在BMSCs向肝细胞诱导分化过程中发挥重要作用。     

LPS对A549和Hela细胞SPLUNC1蛋白表达的影响

 目的 探讨脂多糖(LPS)对人肺腺癌上皮A549细胞和人子宫颈癌上皮Hela细胞短的上腭、肺及鼻咽上皮克隆1(short palate, lung and nasal epithelium clone 1, SPLUNC1)蛋白表达的影响。方法 将两类细胞各随机分为对照组、实验组,CCK-8法观察LPS与细胞增殖活性的时间-反应和剂量-反应关系,筛选各自的最佳效应浓度和作用时间,以LPS最佳效应浓度和作用时间处理后,免疫组化和免疫荧光定量法检测两类细胞SPLUNC1蛋白相对表达量的变化。结果 LPS对A549细胞的最佳效应浓度为20 mg/L,最佳效应时间为12 h,对Hela细胞的最佳效应浓度为40 mg/L,12~24 h为其最佳效应时间窗。SPLUNC1在两类细胞中均呈阳性表达,LPS处理后表达均显著上调(P＜0.05),两类细胞间比较,LPS处理后Hela细胞SPLUNC1相对表达量高于A549细胞(P＜0.05),较对照的增量值(Δ)也明显大于A549细胞(P＜0.05)。结论 SPLUNC1在宫颈癌细胞中存在表达,可能是肺腺癌和宫颈癌病变中的保护性因子,具有潜在的临床应用价值。     

CUGBP1基因对EGCG诱导人肺腺癌A549细胞增殖和凋亡作用研究

目的:研究表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate,EGCG)对人肺癌A549细胞增殖和凋亡影响及与CUGBP1表达的关系。方法:MTT法检测不同剂量EGCG对A549细胞增殖活性的影响;流式细胞仪检测细胞凋亡率;免疫组化和蛋白质印迹法检测各处理组CUGBP1蛋白的表达;Real-Time PCR对CUGBP1mRNA表达进行定量分析。结果:EGCG显著抑制A549细胞增殖活性,F=1 096.65,P<0.001;EGCG孵育4和24hA549细胞的凋亡率分别为(34.10±1.10)%和(51.62±1.50)%,较4和24h正常对照组的(3.90±0.97)%和(1.53±1.11)%明显增加,差异有统计学意义,F=1 254.28,P<0.001。A549细胞细胞核和细胞质内CUGBP1蛋白表达呈阳性,EGCG孵育4h可见A549细胞核CUGBP1蛋白表达呈阴性;孵育24h,部分A549细胞变圆、核固缩,CUGBP1蛋白表达又呈阳性。CUGBP1mRNA定量分析可见,EGCG明显抑制CUGBP1表达,EGCG孵育24h,A549细胞中CUGBP1mRNA相对表达量为(0.71±0.076),较4h的(0.40±0.017)高,差异有统计学意义,t=-6.782,P=0.020。结论:EGCG干扰CUGBP1基因表达抑制人肺癌细胞株A549的增殖,可能是EGCG促进A549细胞凋亡的途径之一。     

iNOS在EGCG促A549细胞凋亡中的作用

目的观察诱导型一氧化氮合酶（iNOs）在表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）促A549细胞凋亡中的作用。方法体外培养A549细胞,随机分为对照组、EGCG组,MTT方法检测筛选EGCG最佳作用浓度,流式细胞仪检测EGCG促A549细胞凋亡作用,免疫组化染色法、蛋白质印迹定量分析法与Real time—PCR方法检测各组中iNOS蛋白和mRNA的表达情况。结果200mg／L的EGCG组细胞增殖活性与其他组比较差异有显著意义（F—1000．35,q=3．43～60．00,P〈0．05）。EGCG组晚期A549细胞凋亡率与对照组比较,差异有显著性（x2 =65．23,P〈0．05）。与对照组比较,EGCG同样可以降低A549细胞中iNOS蛋白与mRNA的表达量,差异有显著性（t=9．4、5．7,P〈0．05）。结论EGCG促A549细胞凋亡可能与下调iNOS蛋白与mRNA的表达量有关。