Wnt10b诱导再生毛囊的表达特性研究

目的 研究Wnt10b诱导再生毛囊的表达特性及诱导作用机制。 方法 HEK-293细胞内扩增并用氯化铯梯度离心纯化Wnt10b过表达腺病毒及对照腺病毒,皮内注射至C57BL/6J小鼠背部皮肤,在处理后2.5、5、7、9、14、28 d时取材,HE染色及免疫组化染色观察毛囊结构特征、信号通路表达特征及增殖特性。 结果 HE染色发现,AdWnt10b处理组从第5天开始出现新生毛囊结构,正常生长,第28天左右进入退化期。免疫组化染色发现,AdWnt10b处理组从处理后5 d开始新生毛囊具有AE15表达,随着毛囊生长而增加,至处理后28 d开始减少。在AdWnt10b处理后5 d,观察到β连环素的核表达,Lef1特异性表达于毛芽和毛母质部位,且全为核表达。在AdWnt10b处理后28 d,Lef1表达减弱。AdWnt10b处理后2.5 d即可见Ki67表达于表皮和毛囊外根鞘。处理后2.5、7、9、14 d均在隆突区见到Ki67的表达;从处理后7 d开始,Ki67表达于毛母质细胞。 结论 Wnt10b诱导的再生毛囊具有正常的毛囊结构,Wnt10b激活了经典Wnt信号通路,其作用的靶细胞是毛囊干细胞及其子代细胞。     

低氧诱导因子-1在小鼠胚胎神经胚形成阶段的发育学表达

为研究低氧诱导因子-1(HIF-1)在小鼠胚胎神经胚形成阶段的时空表达规律,探讨HIF-1在胚胎神经系统发生和发育过程中的作用。本研究以地高辛标记的HIF-1αcRNA为探针,采用全胚胎原位杂交技术,观察HIF-1α在神经胚形成阶段的表达规律。结果显示在E8.5d,整个鼠胚神经管的头端和尾端均可观察到HIF-1αmRNA的表达,此时表达较弱。在E9.5d,随着神经管的逐渐关闭,HIF-1αmRNA在前脑泡、第一鳃弓、第二鳃弓、后脑泡处急剧增多,并在发育中的眼部有较强的表达;此外在中脑泡以及心脏原基有较弱的表达。到E10.5d,阳性信号除在E9.5d检测到的部位继续富集外,在端脑、间脑、发育中的肢芽以及尾部也出现较强的HIF-1αmRNA的表达,且在心脏原基的表达亦进一步增强。E11.5d时在连合板、喙区、第一鳃弓、第二鳃弓、后脑、延脑、发育中的肢芽以及尾部末端可检测到HIF-1αmRNA的明显表达。以上结果提示HIF-1可能参与了小鼠神经胚形成的发育过程。     

The construction of siRNA plasmid targeting mouse HIF-1α and in vitro study of its inhibition effect

Objective

To construct effective RNA-interference plasmids targeting mouse HIF-1α gene and testify their effects and specificities in interfering HIF-1α expression.

Methods

Three RNA-interference plasmids targeting mouse HIF-1α gene, pBS/U6/HIF-1α-siRNAI～III, were constructed and identified using double digestion method in the present study. RT-PCR, immunostaining and western blotting were employed to detect the expression alterations of HIF-1α in 293T cells following transfections of the three plasmids, respectively. The interference effect of pBS/U6/HIF1αi-II in SH-SY5Y cell line was further investigated.

Results

All the three RNA-interference plasmids, especially pBS/U6/HIF1αi-II, showed significant inhibition in HIF-1α expression in 293T cell line. pBS/U6/HIF1αi-II could also inhibit HIF-1α expression in SH-SY5Y cell line, in a dose-dependent way.

Conclusion

Plasmid pBS/U6/HIF1αi-II constructed in our study can effectively and specifically inhibit HIF-1α expression, and its role in neural tube development and dysfunction will be further investigated. Construct of pBS/U6/HIF1αi-II plasmid will provide a useful tool to study the role of HIF-1 pathway in embryogenesis, oncogenesis and ischemia development.     

小鼠STAT3基因干扰质粒的构建及其效果鉴定

目的构建小鼠STAT3基因的特异性RNA干扰质粒,并鉴定其在细胞水平的抑制效果.方法采用DNA载体介导的RNA干扰技术构建小鼠STAT3基因的特异性RNAi质粒(pBS/U6/STAT3-siRNA),并通过RT-PCR、免疫印迹、免疫细胞化学染色等技术对pBS/U6/STAT3-siRNA的抑制效率进行鉴定.结果经双酶切鉴定筛选出4个阳性干扰质粒,分别转入293T细胞后均可明显降低STAT3的表达,尤以靶向( 2 334～ 2 351)位点的质粒干扰效率最高,达70%.结论小鼠STAT3基因的特异性干扰质粒(pBS/U6/STAT3-siRNA)能从蛋白及mRNA水平上特异和高效地抑制STAT3基因的表达.这种DNA载体介导的双链RNA干扰质粒为进一步探究STAT3与胚胎发育的相关功能提供一种有效的研究工具.     

STAT3在小鼠胚胎肝脏的表达

目的探讨STAT3在胚胎肝脏发育中的作用。方法应用免疫组化技术观察STAT3在小鼠胚胎肝脏中期发育中的表达。结果STAT3蛋白在E13．5d鼠胚肝脏中出现较强表达；在E14．5d和E15．5d鼠胚肝脏中的表达有所下降。结论STAT3可能参与了胚胎肝脏中期发育的调控，并可能涉及胚胎肝脏的造血功能。     

STAT3在小鼠胚胎肝脏的表达

目的　探讨STAT3在胚胎肝脏发育中的作用。方法　应用免疫组化技术观察STAT3在小鼠胚胎肝脏中期发育中的表达。结果　STAT3蛋白在E13.5d鼠胚肝脏中出现较强表达 ;在E14 .5d和E15 .5d鼠胚肝脏中的表达有所下降。结论　STAT3可能参与了胚胎肝脏中期发育的调控 ,并可能涉及胚胎肝脏的造血功能。     

RNAi的机制及在医学研究中的应用

RNAi干扰即一些小双链RNA可高效、特异地阻断体内特定基因的表达,导致特异mRNA降解,从而引起生物体内特异基因的沉默,使细胞表现出某种基因表型的缺失。近年来,RNAi这种技术作为一种简单有效的代替基因敲除的遗传工具在医学研究中得到了广泛的应用并有望成为攻克病毒、肿瘤等疾病的有效手段。     

Wnt10b在小鼠毛囊周期中的表达

目的 初步探讨Wnt10b在小鼠毛囊生长周期中的表达变化规律及其意义.方法 首先用RT-PCR检测Wnt10b在小鼠皮肤中的表达情况,然后以免疫组化检测Wnt10b在毛囊生长周期各阶段的表达定位及变化,同时检测了核增殖抗原Ki67在毛母质中的表达情况.结果 Wnt10b在生后第1周期生长期皮肤的mRNA表达量显著高于退化期和静止期(P<0.01),生长中期达到峰值,退化期和静止期呈低表达;第2周期生长早期表达量略高于退化期和静止期.Wnt10b蛋白特异性表达于生长期毛囊的毛母质(Matrix)部位;退化期和静止期在整个毛囊都不表达;第2周期生长早期主要表达于毛囊次级毛芽.Ki67在毛母质中的表达变化情况与Wnt10b具有一致性.结论 Wnt10b的表达具有严格的时空特异性,生后第1周期特异性表达于生长期毛囊的毛母质细胞,第2周期生长早期表达于毛母质细胞的祖细胞次级毛芽,提示Wnt10b可能对毛母质细胞增殖起作用,进而调控毛囊的生长并维持毛囊周期.