RNAi技术干扰人喉癌Hep-2细胞PTTG1基因的初步研究

目的:探索对人PTTG1基因mRNA序列有较高干扰效率的位点,构建对PTTG1基因的表达有较高抑制效率的重组质粒。方法:筛选、合成1对互补DNA单链,退火为双链后与双酶切后的质粒载体连接,构建了表达短发夹RNA的1种重组质粒plk0.1-puro/PTTG1。重组质粒以不同浓度转染,并于转染后不同时间收集细胞,以β-actin为内参,采用RT-PCR和Western blot技术分别检测PTTG1基因的mRNA、蛋白质的相对表达水平。结果:与空白对照组相比,6孔板中每孔转染质粒plk0.1-puro/PTTG 11000ng以上、转染超过12d时,PTTG1基因mRNA、蛋白质的相对表达水平下降70%以上。结论:重组质粒plk0.1-puro/PTTG1,在6孔细胞培养板中以1000ng/孔转染12d以上时,有效抑制了人PTTG1基因的表达,在关于PTTG1基因的研究中具有较好的应用价值。     

肠道病毒71型VP1基因的表达纯化及初步应用

摘　要：目的 表达纯化肠道病毒71型（EV71）VP1蛋白,初步建立人血清中抗EV71 IgG间接ELISA检测方法。方法 通过化学法合成肠道病毒EV71型VP1全基因序列,构建重组质粒pET-43.1a(+)/VP1,转化大肠杆菌Bl21（DE）3 ,IPTG诱导表达,镍金属亲和层析纯化目的蛋白,产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定。以目的蛋白作为包被抗原,初步建立间接ELISA 检测方法。结果 成功构建重组质粒pET-43.1a(+)/VP1,表达纯化出较高纯度的EV71 VP1融合蛋白,初步建立人血清中抗EV71 IgG间接ELISA 检测方法。检测77份6-10岁健康儿童、手足口病现症患儿血清中抗EV71 VP1 IgG抗体阳性率分别为51.22%、61.11%。结论 表达产物具有较好的免疫原性,可用于肠道病毒EV71抗体检测试剂盒的研制。     

含A(H1N1)流感病毒NP基因病毒样颗粒的构建和表达

目的:构建并表达含有A(H1N1)流感病毒NP基因片段并可抗RNase降解的病毒样颗粒,作为RT-PCR检测的阳性对照.方法:设计带有Nco Ⅰ、BamHⅠ酶切位点的引物克隆MS2噬菌体的装配蛋白和包膜蛋白基因,化学合成含BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点的A(H1N1)流感病毒NP基因片段,将这些基因连接到质粒载体pET-28b(+)上,转化到E.coli BL21(DE3)感受态细胞中进行表达,表达产物进行纯化,然后进行RNase攻击试验和稳定性试验.结果:获得含NP基因片段的病毒样颗粒,可抵抗RNase降解,并能在37℃稳定保存30 d.结论:该病毒颗粒稳定、安全、可靠,可作为A(H1N1)流感病毒RT-PCR检测、定量分析的有效阳性参考品.     

甲型（H1N1）（2009）流感病毒三重RT-PCR快速检测方法的建立

目的建立一种早期快速检测甲型（H1N1）（2009）流感流行病毒株的方法。方法将2009年分离的甲型（H1N1）流感流行病毒株基因与以前的流感病毒株进行序列比对,找出其特异的基因序列,设计针对甲型（H1N1）（2009）流行株的血凝素（HA）、神经氨酸酶（NA）、核蛋白（NP）基因的三对特异引物,采用RT-PCR同时扩增三条目的片段,通过琼脂糖凝胶电泳进行检测。结果此方法对临床标本的阳性检出率为71%。结论采用三重PCR同时扩增甲型（H1N1）（2009）流感流行病毒的三段特异序列既缩短检测时间又提高了检测特异性,无交叉反应,是一种有效可行的快速检测甲型（H1N1）（2009）流感流行病毒株的方法。