骨形成发生蛋白9的siRNA筛选及功能检测

目的 筛选特异性沉默小鼠BMP9基因的siRNA序列,在BNLCL.2胚胎肝细胞及C3H10细胞进行功能鉴定.方法 体外退火获得4组simBMP9双链DNA序列,克隆至含有BMP9靶基因的pSOS-BMP9质粒中获得pSOS-simBMP9质粒,脂质体转染HEK293细胞,GFP检测筛选有功能的simBMP9片段,将筛选出的simBMP9构建腺病毒,感染BNLCL.2胚胎肝细胞,通过RT-PCR,Western blotting检测BMP9的表达,simBMP9与BMP9腺病毒共感染C3H10细胞, 碱性磷酸酶活性检测simBMP9对BMP9成骨诱导的抑制作用.结果 在HEK293细胞中,四组simBMP9中有两组的GFP表达明显降低,同时,腺病毒介导的这两对simBMP9均能抑制胚胎肝细胞中内源性的BMP9表达,抑制率为50%～70%,BMP9能诱导C3H10细胞的成骨分化,碱性磷酸酶的活性明显高于对照组(P<0.01),而两组simBMP9与BMP9共感染组C3H10细胞的ALP活性均明显的低于BMP9组(P<0.01).结论 成功筛选出两对特异性沉默BMP9基因的siRNA片段,能有效抑制内源性和外源性的BMP9表达,为研究BMP9在肝细胞成熟分化中的作用及具体机制提供重要的分子手段.     

显性负性突变型TGF-β Ⅰ型受体腺病毒的构建和功能验证

目的：构建制备显性负性突变型转化生长因子（TGF-β）Ⅰ型受体腺病毒,并验证其对于相应配体功能的抑制效应．方法：利用分子克隆技术构建和重组腺病毒技术,构建制备显性负性突变型TGF-β Ⅰ型受体腺病毒,并用其感染C3HIO细胞,采用荧光显微镜观察和RT-PCR证明显性负性突变型TGF-β Ⅰ型受体腺病毒在C3H10细胞中的表达．采用碱性磷酸酶（ALP）定量和荧光素酶报告基因实验,分析显性负性突变型TGF-β Ⅰ型受体腺病毒对骨形成蛋白2（BMP2）,TGF-β Ⅰ功能的影响,证明其抑制相应配体功能的有效性．结果：构建和制备了显性负性突变型TGF-β Ⅰ型受体腺病毒,其可以感染C3H10细胞并在C3H10细胞中表达相应的显性负性TGF-β Ⅰ型受体;特定的显性负性突变型TGF-β Ⅰ型受体腺病毒可分别抑制由BMP2诱导的ALP活性及由TGF-β Ⅰ诱导的荧光素酶活性．结论：成功构建制备的7种显性负性突变型TGF-β Ⅰ型受体腺病毒具有抑制相应配体功能的特性,为分析TGF-β Ⅰ型受体功能及靶向TGF-β 信号通路的基因治疗提供了有用的工具．     

浅说医学实验教学准备

目的探讨医学实验室准备工作。方法文献调研与实验师经验座谈。结果实验教学成为医学教育的重要环节和人才培养的主要内容,在实现培养具有科学精神实践能力和创新意识的高质量医学人才上,具有举足轻重的作用。结论为了保障实验教学的质量,实验准备至关重要。     

重组腺病毒介导的骨形态发生蛋白9与骨形态发生蛋白2复合纳米羟基磷灰石/聚酰胺多孔支架修复桡骨缺损的比较

背景:课题组采用新的重组腺病毒介导的基因表达手段,与传统方法比较具有高效、方便、安全等优点,可作为进入临床基因治疗应用的潜在有力手段.目的:比较腺病毒介导的人骨形态发生蛋白9(Adv-hBMP-9)与腺病毒介导的人骨形态发生蛋白2(Adv-hBMP-2)分别复合纳米羟基磷灰石/聚酰胺多孔支架材料修复重建桡骨缺损的效果.方法:新西兰白兔36只,随机分成3组,制成双侧桡骨中段13 mm骨缺损模型.分别植入Adv-hBMP-9+纳米羟基磷灰石/聚酰胺骨、Adv-hBMP-2+纳米羟基磷灰石/聚酰胺骨、Adv-GFP+羟基磷灰石,聚酰胺骨.植入后进行大体观察、X射线摄片、组织学检测.结果与结论:BMP-9组骨缺损完全修复,BMP-2组骨缺损部分修复,而GFP对照组骨缺损修复明显欠佳.提示重组腺病毒介导的BMP-9对桡骨骨缺损后的成骨修复作用强于BMP-2.     

HBX基因逆转录病毒载体的构建及在LO2细胞内的稳定表达

目的 构建乙型肝炎病毒X基因(HBX)逆转录病毒载体,并使其在人正常肝细胞LO2内的进行稳定表达.方法 PCR扩增HBX基因,克隆到逆转录病毒载体质粒pSEB-Flag中,构建表达HBX的重组逆转录病毒载体质粒pSEB-Flag-HBX,通过通过PCR、酶切、测序验证HBX基因后;体外将重组质粒pSEB-Flag-HBX与包装质粒pAmpho共同转染人胚胎肾上皮细胞系293T细胞,包装获得携带HBX基因的重组逆转录病毒,并感染靶细胞人正常肝细胞LO2,稻瘟菌素(Blasticidin)筛选,获得成功转入HBX的LO2细胞.通过RT-PCR和Western blot进一步验证HBX基因及HBx蛋白在LO2细胞内的表达.结果 (1)成功获得携带HBX基因的阳性重组质粒pSEB-Flag-HBX;(2)HBX基因被逆转录病毒成功地导入靶细胞LO2细胞,并实现稳定表达,RT-PCR检测到HBX mRNA在靶细胞中的表达,Western blot检测到HBx蛋白在靶细胞LO2-HBx细胞中的表达.结论 成功构建了携带HBX基因的重组逆转录病毒载体,感染人正常肝细胞LO2后能够稳定表达HBx蛋白,为进一步探讨HBx在肝癌发生发展中的作用提供了较为理想的实验模型.     

国产大型厌氧菌手套箱

厌氧菌手套箱(Anaerobic glove box)是迄今为止国际上公认的培养厌氧菌的最佳仪器之一。其优点是把厌氧菌的实验操作,包括孵育都置于完全无氧的环境中进行,避免了其他厌氧菌培养方法在有氧环境中操作,     

重组腺病毒介导的骨形态发生蛋白9与骨形态发生蛋白2复合纳米羟基磷灰石/聚酰胺多孔支架修复桡骨缺损的比较*◆

摘要 背景：课题组采用新的重组腺病毒介导的基因表达手段,与传统方法比较具有高效、方便、安全等优点,可作为进入临床基因治疗应用的潜在有力手段。 目的：比较腺病毒介导的人骨形态发生蛋白9(Adv-hBMP-9)与腺病毒介导的人骨形态发生蛋白2(Adv-hBMP-2)分别复合纳米羟基磷灰石/聚酰胺多孔支架材料修复重建桡骨缺损的效果。 方法：新西兰白兔36只,随机分成3组,制成双侧桡骨中段13 mm骨缺损模型。分别植入Adv-hBMP-9+纳米羟基磷灰 石/聚酰胺骨、Adv-hBMP-2+纳米羟基磷灰石/聚酰胺骨、Adv-GFP+羟基磷灰石/聚酰胺骨。植入后进行大体观察、X射线摄片、组织学检测。 结果与结论：BMP-9组骨缺损完全修复,BMP-2组骨缺损部分修复,而GFP对照组骨缺损修复明显欠佳。提示重组腺病毒介导的BMP-9对桡骨骨缺损后的成骨修复作用强于BMP-2。 关键词：人骨形态发生蛋白9;人骨形态发生蛋白2;腺病毒;纳米羟基磷灰石;聚酰胺;骨缺损;成骨作用 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.21.004