RNAi技术干扰人喉癌Hep-2细胞PTTG1基因的初步研究

目的:探索对人PTTG1基因mRNA序列有较高干扰效率的位点,构建对PTTG1基因的表达有较高抑制效率的重组质粒。方法:筛选、合成1对互补DNA单链,退火为双链后与双酶切后的质粒载体连接,构建了表达短发夹RNA的1种重组质粒plk0.1-puro/PTTG1。重组质粒以不同浓度转染,并于转染后不同时间收集细胞,以β-actin为内参,采用RT-PCR和Western blot技术分别检测PTTG1基因的mRNA、蛋白质的相对表达水平。结果:与空白对照组相比,6孔板中每孔转染质粒plk0.1-puro/PTTG 11000ng以上、转染超过12d时,PTTG1基因mRNA、蛋白质的相对表达水平下降70%以上。结论:重组质粒plk0.1-puro/PTTG1,在6孔细胞培养板中以1000ng/孔转染12d以上时,有效抑制了人PTTG1基因的表达,在关于PTTG1基因的研究中具有较好的应用价值。     

含A(H1N1)流感病毒NP基因病毒样颗粒的构建和表达

目的:构建并表达含有A(H1N1)流感病毒NP基因片段并可抗RNase降解的病毒样颗粒,作为RT-PCR检测的阳性对照.方法:设计带有Nco Ⅰ、BamHⅠ酶切位点的引物克隆MS2噬菌体的装配蛋白和包膜蛋白基因,化学合成含BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点的A(H1N1)流感病毒NP基因片段,将这些基因连接到质粒载体pET-28b(+)上,转化到E.coli BL21(DE3)感受态细胞中进行表达,表达产物进行纯化,然后进行RNase攻击试验和稳定性试验.结果:获得含NP基因片段的病毒样颗粒,可抵抗RNase降解,并能在37℃稳定保存30 d.结论:该病毒颗粒稳定、安全、可靠,可作为A(H1N1)流感病毒RT-PCR检测、定量分析的有效阳性参考品.     

丹鹿健腰颗粒质量标准研究

目的建立丹鹿健腰颗粒的质量控制标准。方法采用TLC法对丹鹿健腰颗粒中的丹参、夏天无及鹿衔草进行定性鉴别;应用HPLC法对丹鹿健腰颗粒中的丹酚酸B、原阿片碱进行定量测定。结果丹参、夏天无及鹿衔草的TLC鉴别方法专属性强,简单可行。丹酚酸B、原阿片碱分别在0.4~2.0、0.3~1.2μg范围内呈良好的线性关系,r均为0.9999;平均回收率（n=6）分别为99.3%（RSD为0.7%）、98.8%（RSD为1.2%）。结论本研究所建立的质量标准方法稳定、准确、重复性好,可用于丹鹿健腰颗粒的质量控制。     

天芎头风片质量标准研究

目的建立天芎头风片的质量标准。方法采用显微鉴别法对方中全蝎进行鉴别;采用薄层色谱法对方中川芎、延胡索进行定性鉴别;采用高效液相色谱法对天芎头风片中天麻素进行含量测定。结果全蝎的显微鉴别方法专属性强,简单可行。川芎、延胡索的薄层色谱鉴别方法斑点清晰,重现性好。天麻素进样量在0.44-1.31μg范围内与峰面积呈良好线性关系,r=0.999 5;平均回收率为99.76%,RSD=1.17%（n=6）。结论所建立的方法稳定、准确、重复性好,可用于天芎头风片的质量控制。     

清开灵注射液的氨基酸成分测定

目的:测定清开灵注射液的氨基酸含量。方法:利用氨基酸自动分析仪进行检制。结果:从清开灵注射液中测出了16种氨基酸,总含量为20.9mg/100mg,含量最高的为谷氨酸3.92mg/100mg,含量最低的为组氨酸0.01mg/100mg。结论:该注射液含有6种人体必需的氨基酸,占该药氨基酸总含量的37.7%。     

A型流感病毒M2e单克隆抗体的研制及鉴定

目的 制备A型流感M2e(2-24)单克隆抗体,并进行初步研究.方法 以M2e-OVA免疫BALB/c小鼠,取免疫后的小鼠脾细胞和SP2/0细胞融合,经有限稀释法克隆化及筛选,获得抗M2e(2-24)的杂交瘤细胞株,制备腹水,并对其进行纯化,分析和鉴定.结果 获得3株稳定分泌M2e单克隆抗体的杂交瘤细胞株L1,L2,L3,其免疫球蛋白亚类均为IgG1,腹水效价为105以上. 结论 成功制备了抗M2e(2-24)的特异性单克隆抗体,为研制具有交叉保护作用的流感疫苗奠定了基础.     

甲型（H1N1）（2009）流感病毒三重RT-PCR快速检测方法的建立

目的建立一种早期快速检测甲型（H1N1）（2009）流感流行病毒株的方法。方法将2009年分离的甲型（H1N1）流感流行病毒株基因与以前的流感病毒株进行序列比对,找出其特异的基因序列,设计针对甲型（H1N1）（2009）流行株的血凝素（HA）、神经氨酸酶（NA）、核蛋白（NP）基因的三对特异引物,采用RT-PCR同时扩增三条目的片段,通过琼脂糖凝胶电泳进行检测。结果此方法对临床标本的阳性检出率为71%。结论采用三重PCR同时扩增甲型（H1N1）（2009）流感流行病毒的三段特异序列既缩短检测时间又提高了检测特异性,无交叉反应,是一种有效可行的快速检测甲型（H1N1）（2009）流感流行病毒株的方法。