多种病毒集合检测芯片的研制及其在临床血清标本检测中的初步应用

目的 研制黄热病、西尼罗热、登革热、基孔肯雅热、埃博拉出血热、马尔堡出血热、拉沙热等多种病毒性传染病集合检测基因芯片,并建立一种适用于直接检测核酸含量较低临床血清标本的新型芯片靶基因扩增标记方法.方法 设计并筛选出上述病毒70mer寡核苷酸特异探针各20条,打印于同一基因芯片上；以phi29 DNA聚合酶结合带标签序列的随机引物进行临床标本中病毒全基因组扩增,再以Cy3荧光染料标记的标签序列引物进行PCR随机扩增标记,标记产物用多种病毒芯片进行杂交检测.结果 检测1～4型登革热、基孔肯雅热病例临床血清标本,结果显示该方法准确、特异、敏感；检测西尼罗热、黄热病、埃博拉出血热、马尔堡出血热、拉沙热等病毒核酸的模拟血清标本,同样得到特异的阳性杂交信号,与预期结果一致.结论 本研究建立的多种病毒集合检测基因芯片及其靶基因扩增标记方法,可直接应用于血清标本中上述病毒核酸的检测.     

广东国境口岸中央空调水嗜肺军团菌检测及结果分析

目的:为了解广东地区国境口岸中央空调冷凝水中军团菌的阳性率,分析军团菌对出入境旅客健康的潜在危害并为北京奥运会期间国境口岸军团菌防控提供理论依据。方法:通过对2007年度和2008年度广东地区6个国境口岸中央空调冷凝水的采集、处理,利用分离培养、乳胶凝集试验、血清学分型等方法对样本进行军团菌的检测及血清学分型,检验依据为ISO11731:1998。对检测结果进行分析。结果:2007年度从63份样本中检出军团菌7例,检测阳性率为11.1%,其中嗜肺军团菌4例;2008年度从46份样本中检出军团菌3例,检测阳性率为6.5%,全部为嗜肺军团菌。结论:本次军团菌检出率略低于有关文献报道的全国平均检出率,阳性样本中嗜肺军团菌L1型占比率较大(30%);本研究结果有利于分析国境口岸空调通风系统的卫生状况,为口岸卫生控制提供技术指导,有利于北京奥运会和谐、顺利举办。     

江门市2004年卫生违法案例行政处罚情况分析

目的通过对江门市行政处罚案件总结和分析，找出卫生行政执法中存在的问题和今后卫生执法工作重点。方法分析该市2004年1004宗行政处罚案件，案由分类按照《全国卫生监督机构工作规范》2001版；案件来源分类按《卫生行政处罚程序》第十四条规定；行业分类按卫统12表3食品卫生监督监测年报表和卫统20表公共场所监督监测年报表。结果2004年共查处违法案件1004宗，罚款金额459987元，罚款最低50元／宗，最高22400元／宗，平均罚款458元／宗；违反《食品卫生法》的案例数最多，占93．8％；案由分类中无证经营食品案的案例数最多，占67．8％，每宗案件平均罚款金额最高的是食物中毒(食源性)疾患肇事案，13212元／宗；共没收销毁产品33894．5kg，其中违反食品添加剂管理案的最多，为17566．5kg；个体户违法案例数最多，占87．4％；批发零售业案例数最多，为60．4％，饮食业其次，占22．6％；案件来源：卫生监督管理中发现的最多，占77．8％(675宗)，其次是社会举报，占13．8％(139宗)。结论食品卫生监管仍是今后江门市卫生监督工作的重点，要加强对个体经营户特别是小饮食店的监管，加强对餐饮具不符合卫生案件的查处；加强对食品生产厂(场)食品添加剂的监督管理；加强卫生监督，主动发现违法案件，鼓励社会举报；加强法制教育和卫生知识培训；加强信息化建设。     

疟疾的实时荧光PCR快速检测方法

目的:建立疟疾的实时荧光PCR检测方法并用于疟疾的快速检测。方法:设计了疟原虫通用型实时荧光PCR检测的引物和探针,建立了疟疾的实时荧光PCR检测方法。对40份疟疾镜检阳性样本和20份镜检阴性样本进行实时荧光PCR检测,并和巢式PCR方法检测结果进行了比较。结果:疟疾实时荧光PCR检测速度快,20分钟即可完成。40份镜检阳性样本的荧光PCR检测均为阳性,2份样本的巢式PCR结果为阴性;20份镜检阴性样本中有3份样本为实时荧光PCR阳性,其余17份样本为实时荧光PCR阴性,与疟疾巢式PCR检测结果相同。结论:该实时荧光PCR方法检测速度快,特异性强,准确性高,阳性率高,不易漏检,适用于疟疾的快速检验,这对防止该病在国境口岸的传入提供了技术依据。     

实时荧光RT-PCR技术在黄热病快速检测中的应用

[目的]建立黄热病病毒的实时荧光RT-PCR检测方法并用于口岸黄热病的快速检测. [方法]体外转录黄热病病毒5-UTR的部分序列核酸作为阳性对照模板,设计实时荧光RT-PCR不同的反应程序和引物/探针浓度的组合,摸索最佳反应体系条件并用于黄热病疫苗和入境发热患者标本的检测.[结果]建立的黄热病病毒的实时荧光RT-PCR检测方法最佳反应体系为:2xRT-PCR缓冲液10 μl,正向引物5UTR-FP终浓度750 nM,反向引物5UTR-RP终浓度750 nM,探针5UTR-Probe终浓度500 nM,25xRT-PCR Enzyme Mix 0.8μl,RNA 5μl,用DEPC H2O补足到反应总体积20μl;Roche lightcycler仪器适用的扩增程序为:45℃10 min,95℃10 min;95℃5 s,56℃10 s(single),72℃15 s,45次循环.该方法最低检测限约为20copies病毒/反应,与登革病毒、西尼罗病毒、日本脑炎病毒、基孔肯雅病毒等蚊媒病毒无交叉反应.应用该方法对黄热病疫苗、媒介蚊虫和入境发热患者的血清标本进行检测,结果为黄热病疫苗核酸阳性,其他标本为阴性.[结论]该实时荧光RT-PER方法灵敏度高,特异性强,适用于黄热病病毒的快速检验,防止该病在国境口岸的传入.     

2009－2012年广东口岸输入性流感疫情监测结果分析

目的对2009—2012年广东口岸输入性流感病例的流行病学特征进行分析,为出入境口岸流感的监测及其防控工作提供依据。方法采集广东25个口岸有发热症状的入境人员的鼻咽拭子,采用实时荧光RT-PCR法对样本进行流感病毒的检测及分型．通过Excel、SPSS18．0对不同型别的流感阳性病例的流行情况进行统计分析。结果2009—2012年广东口岸共发现5723名发热病例,其中985例为输入性流感病例,检出率为17．21％。共呈现5个流行高峰,分别为2009年6—8月,以季节性甲型流感为主;2009年10-12月,以甲型H1N1流感（2009）为主;2010年7-9月,以季节性甲型流感为主;2010年12月-2011年2月,以甲型H1N1流感（2009）为主;2011年12月-2012年2月,以季节性乙型流感为主。甲型H1N1流感（2009）在19岁以下人群检出率较高,季节性甲型流感以50岁以上人群检出率最高,季节性乙型流感则以19岁以下及50岁以上人群检出率较高。结论2009年5月至2012年2月期间,广东口岸入境流感病例中同时有甲型H1N1流感（2009）、季节性甲型流感以及季节性乙型流感的流行,并呈现相互交替的流行特征。不同流感类型在各年龄层分布不同．与性别无关。     

一种无RNA纯化步骤TaqMan RT-PCR方法用于快速检测登革病毒

目的 建立一种简便、快速的登革病毒核酸检测方法.方法 设计合成LNA探针,替代MGB探针,建立一步法TaqMan RT-PCR方法,并用已知的登革病毒标准毒株进行方法的优化;用商品化的纯化试剂盒和简单的热释放法获取登革病毒细胞培养液和模拟含登革病毒血清中RNA,以优化的TaqMan RT-PCR方法进行检测,比较有或无RNA纯化步骤检测的敏感性和重复性.结果 LNA探针TaqMan RT-PCR有较好的PCR扩增效率(104%)、较广的线性范围(10 0～10-7样品稀释度)、较高的敏感性(0.003TCID50/反应)和较好的重复性(CV值小于4.53%),新方法检测经简单热释放RNA的细胞培养液和模拟含登革病毒血清中登革病毒也有较高的敏感性(0.03TCID50/反应)和较好的重复性(CV值小于6.36%).结论 新型LNA探针可替代MGB探针用于TaqMan RT-PCR反应,简便的热释放RNA方法结合高敏感性的TaqMan RT-PCR可满足登革病毒快速检测的需要.     

委内瑞拉马脑炎的研究进展

委内瑞拉马脑炎（Venezuelan equine encephalitis,VEE）是由委内瑞拉马脑炎病毒复合物（VEEV复合物）引起的自然疫源性疾病,历史上引起了多次暴发流行。VEEV还是一种潜在的、可以用于战争和恐怖活动的生物武器。本文就VEE的病原学、流行病学、临床表现、实验室检测、治疗和预防等方面予以综述。     

抗人禽流感病毒H5N1人源化单链抗体噬菌体文库的构建和筛选

目的 利用抗人禽流感病毒H5N1 IgG抗体阳性的人禽流感康复患者外周血淋巴细胞,构建人源化Fv段单链抗体(seFv)噬菌体文库,并筛选与禽流感病毒相关蛋白有结合活性的scFv抗体文库.方法 提取人外周血淋巴细胞总RNA,逆转录成cDNA,以其为模板,利用家族特异性IgG基因的引物,扩增重链和轻链的可变区基因,并用合成的连接子将轻链和重链基因连接成单链抗体片段后,重组到噬菌粒载体pCANTAB5E中.将重组噬菌粒载体电转化大肠杆菌TG1,酶切和PCR鉴定抗体库的重组率,通过测定噬菌体抗体库的滴度计算抗体库的库容,用特异性禽流感病毒相关蛋白筛选表达的单链抗体.结果 构建了源于人禽流感康复患者血清的scFv抗体文库,库容为3.75×104;筛选出与禽流感病毒相关蛋白有结合活性的scFv抗体文库.结论 成功构建了抗人禽流感病毒H5N1的人源scFv噬菌体抗体库,并筛选出特异性结合人禽流感病毒相关蛋白的单链抗体,为进一步制备快速检测试剂和治疗研究提供了基础数据.     

南方五省口岸蚊类携带虫媒病毒调查

[目的]掌握南方口岸蚊媒携带病毒的本底资料,为蚊传疾病的预防控制工作提供依据。[方法]采用电动吸蚊器人工法和捕蚊磁场自动法采集南方5省口岸各类蚊虫。采集到的蚊类超低温送至实验室,研磨处理后用荧光PCR方法检测登革病毒、乙脑病毒、黄热病毒、西尼罗病毒、基孔肯雅病毒等重要蚊媒病毒,结果阳性的标本进一步进行PCR扩增和核苷酸序列测定分析;蚊标本研磨液同时用C6／36细胞进行虫媒病毒分离培养,出现细胞病变后分别用黄病毒科、甲病毒科各自的通用引物进行鉴定;对未能鉴定的未知病毒进一步用随机PCR方法进行扩增、克隆、序列测定、Blast搜索。[结果]从南方5省口岸采集到各类蚊虫12575只,鉴定后共分成254组。各组标本经荧光PCR方法检测,结果登革病毒、黄热病毒、西尼罗病毒、基孔肯雅病毒均为阴性;检测到2份福建省来源三带喙库蚊的标本乙脑病毒核酸阳性,经乙脑病毒E基因引物PCR扩增、测序分析证实为GⅠ型病毒。254份标本经C6／36细胞分离培养出现42份细胞病变,用黄病毒科、甲病毒通用引物PCR扩增,均未得到特异片段。选取1份典型病变的细胞培养物进行随机PCR鉴定,结果发现了1种潜伏于C6／36细胞中的浓核病毒。[结论]南方5省口岸蚊媒中可能未携带登革病毒、黄热病毒、西尼罗病毒、基孔肯雅病毒等重要蚊媒病毒,只有少量蚊虫携带乙脑病毒,蚊虫体内检测到的GⅠ型乙脑病毒属于福建省首次发现,出现病变的C6／36细胞可能是由自身潜伏的1种C6／36细胞浓核病毒引起。