泛素特异性蛋白酶25在颞叶癫痫大鼠颞叶皮质中表达变化的实验研究

目的探讨海人酸点燃杏仁核大鼠颞叶癫痫模型颞叶皮质中泛素特异性蛋白酶25(USP25)的表达情况。方法将52只SD雄性大鼠按随机数字表法分为癫痫模型组(共39只)和假手术对照组(简称对照组,13只)。癫痫模型组建立海人酸点燃杏仁核大鼠颞叶癫痫模型,再按构建成功的时间分为3组(构建成功1 d为急性期组、构建成功7 d为潜伏期组、构建成功30 d为慢性期组,每组各13只),在观察结束时取材。对照组在杏仁核注入生理盐水,与癫痫模型组伴随取材。免疫组织化学染色及免疫荧光双标法检测USP25在颞叶皮质中的表达及与神经元(NeuN)和星形胶质细胞(GFAP)的共定位情况;实时荧光定量PCR法和蛋白免疫印迹法检测USP25在颞叶皮质中的表达变化。结果在注药侧颞叶皮质中,癫痫模型组USP25与NeuN的共定位阳性细胞在癫痫后期增加,USP25 mRNA及蛋白水平在癫痫发作不同时期的表达差异均有统计学意义(F值分别为25.48、7.68,均P<0.05)。与对照组(mRNA:1.00±0.36;蛋白:1.00±0.46)比较,潜伏期组(mRNA:10.80±4.82;蛋白:1.88±0.32)和慢性期组(mRNA:12.97±4.48;蛋白:1.92±0.26)的表达水平显著增加,差异均有统计学意义(均P<0.05)。在未注药侧皮质中,USP25 mRNA及蛋白水平在癫痫发作不同时期的表达差异也均有统计学意义(F值分别为86.86、6.65,均P<0.05)。结论颞叶皮质中USP25的表达在癫痫大鼠潜伏期后增加,提示去泛素化通路参与颞叶癫痫的慢性病理过程。     

MAPKs信号通路干预对体外培养大鼠星形胶质细胞划痕损伤后水通道蛋白4表达的影响

目的研究体外培养大鼠星形胶质细胞划痕损伤后水通道蛋白4(aquaporin4,AQP4)表达变化,并观察丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)信号通路特异性抑制剂对此变化的影响。方法利用传代培养10d左右的大鼠星形胶质细胞制作划痕损伤模型,部分实验于划痕损伤前1h分别加入ERK抑制剂U0126,p38MAPK抑制剂SB203580及JNK抑制剂SP600125。观察细胞形态变化、GFAP免疫细胞化学染色变化,并用实时荧光定量PCR法检测AQP4mRNA表达变化。结果划痕损伤后12h,细胞形态由扁平形变为不规则形,部分细胞突起向划痕区伸出,划痕区出现GFAP免疫化学染色阳性细胞,AQP4mRNA表达水平明显降低(P<0.05),而U0126,SB203580和SP600125预处理均能阻止此种变化(P<0.05)。结论划痕损伤引起培养星形胶质细胞AQP4mRNA表达下调,MAPKs抑制剂可对抗此作用,提示MAPKs信号通路参与星形胶质细胞损伤后AQP4表达变化的调节。     

体外培养大鼠星形胶质细胞划伤模型

目的复制体外培养大鼠星形胶质细胞划伤模型。方法利用传至第2代的体外培养的大鼠星形胶质细胞进行细胞划伤实验。分别于划伤前10min、划伤后1、3、6、12、24h观察细胞形态变化,并取培养上清液进行乳酸脱氢酶活性测定。结果细胞划伤后划痕两侧边缘整齐,随时间推移细胞突起逐渐向划痕区延伸,且划痕区出现星形胶质细胞。细胞划伤后乳酸脱氢酶漏出量短时间内迅速增加,之后各时间点持续增加(P<0.05),且均高于相应时间点的对照组(P<0.05)。结论细胞形态变化及培养上清液中乳酸脱氢酶漏出量证实体外培养大鼠星形胶质细胞划伤模型复制成功。     

腹腔注射乙烯雌酚大鼠垂体前叶非组织特异性中性半胱氨酸蛋白酶u-及m-calpains的活性及时相变化

Little is known about changes in calpain activity in the pituitary gland.In the present study,μ-and m-calpain activity changes were detected in the rat anterior pituitary following intraperitoneal injection of diethylstilbestrol.Double-immunofluorescence labeling confirmed colocalization of μ-and m-calpain in prolactin-secreting cells(lactotrophs).Western blot analysis revealed significantly increased expression of both calpains,which accompanied upregulated cytosol and membrane zymographic activities at 12 weeks following diethylstilbestrol injection,compared with rats injected with sunflower oil.Moreover,following estrogen injection,pituitary gland pathological damage gradually worsened with increasing time.Results demonstrated that estrogen regulated calpain expression and activity,and both calpains participated in the pathophysiological processes of the pituitary gland.Ubiquitous calpain expression could serve as an effective target for anti-estrogen drugs.     

人脑胶质瘤培养组织对化疗药物的敏感性

  目的 观察培养的人脑胶质瘤组织对临床常用化疗药物的敏感性,为胶质瘤的个体化治疗提供实验依据。 方法 利用112例脑胶质瘤标本进行组织块体外培养,观察其对临床脑胶质瘤治疗常用药物尼莫司汀(ACNU)、顺铂(DDP)、替莫唑胺(TMZ)、长春新碱(VCR)、替尼泊苷(VM26)及组合用药DDP＋VM26的敏感性,比较化疗药物体外抗肿瘤作用的差异;分析化疗药物敏感性与患者病理分级的相关性;应用透射电镜观察化疗药物作用前后肿瘤组织超微结构的变化。 结果 人脑胶质瘤培养组织对化疗药物的敏感性依次为DDP＋VM26、VM26、TMZ、VCR、DDP和ACNU;仅组合用药DDP＋VM26的敏感性与患者病理分级有关(χ²=4.447,P=0.035);透射电镜观察发现化疗药物作用后肿瘤细胞呈凋亡中晚期改变及坏死的变化。 结论 不同人脑胶质瘤培养组织对化疗药物的敏感性存在差异,引起肿瘤细胞凋亡或坏死可能是化疗药物发挥作用的机制之一。     

水通道蛋白1、4在培养大鼠星形胶质细胞、BT325细胞及人脑胶质瘤组织中的表达

目的 水通道蛋白作为细胞膜特异性水转运蛋白在脑内分布广泛,参与脑内水平衡调节,与脑肿瘤、脑创伤等多种疾病导致的脑水肿有关.本实验主要研究水通道蛋白1、4在培养大鼠星形胶质细胞、人多形性胶质母细胞瘤系BT325细胞及人脑胶质瘤组织中的表达情况.方法 应用胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫细胞化学染色鉴定培养大鼠星形胶质细胞及BT325细胞.应用反转录PCR法检测GFAP、AQP1及AQP4在不同组织细胞中的表达.结果 实验中培养大鼠星形胶质细胞及BT325细胞GFAP免疫细胞化学染色阳性.体外培养大鼠星形胶质细胞、人胶质母细胞瘤组织及对照组标本均有GFAP表达,同时也有AQP1及AQP4表达.BT325细胞只有GFAP表达,无AQP1及AQP4表达.结论 AQP1、4在培养大鼠星形胶质细胞及胶质瘤组织中均有表达,可能对脑功能的维持及肿瘤性脑水肿的发生、消散有重要影响.     

人脑多形性胶质瘤细胞系BT325对5种抗肿瘤药物敏感性的研究

目的检测人脑多形性胶质瘤细胞系BT325对顺铂(DDP)、替尼泊甙(VM26)、尼莫斯汀(ACNU)、替莫唑胺(TMZ)及长春新碱(VCR)5种临床常用抗肿瘤药物的敏感性,筛选脑胶质瘤化疗敏感药物。方法用含0%、10%及20%胎牛血清的DMEM培养基培养BT325胶质瘤细胞,分别在24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h进行细胞计数,绘制细胞生长曲线,以确定细胞生长的最佳血清浓度;采用CCK-8法检测不同血浆峰浓度(PPC)5种药物对BT325胶质瘤细胞活性的影响,计算抗肿瘤药物的抑制率及IC50。结果细胞形态观察及细胞生长曲线显示含10%胎牛血清的DMEM培养基对BT325胶质瘤细胞生长较为适宜。细胞活性检测显示DDP在0.625×PPC(抑制率为51.8%)及以上浓度时可抑制BT325细胞生长,在1.25×PPC(抑制率为75.1%)及以上浓度时BT325细胞高度敏感,且有量效关系;VM26对BT325细胞抑制率均在79.6%以上,为高度敏感,剂量范围广且存在量效关系;VCR各浓度对BT325细胞抑制率为50%左右,但是与药物剂量无关;各浓度ACNU、TMZ对BT325细胞抑制率均在34%以下,无抑制作用。结论 BT325胶质瘤细胞对DDP、VM26敏感,对VCR、ACNU、TMZ不敏感。     

实验教学对医学及护理研究生科研能力的影响

随着医疗卫生事业的迅速发展,医学及护理研究生的培养受到广泛重视。医学及护理研究生科研能力的培养在整个研究生培养体系中占有重要位置,包括生物化学、分子生物学及细胞培养等在内的实验教学对医学及护理研究生科研能力的培养有重要影响。其中的细胞培养实验教学不仅使学生学到了细胞培养的相关知识,也使其认识到无菌观念的重要性,对其今后从事临床及护理工作非常重要;同时,细胞培养实验教学能提高医学及护理研究生创新能力、思维能力、观察能力、实际操作能力、统筹能力及协调能力等科研能力。     

褪黑素对长期接受己烯雌酚(DES)大鼠垂体非组织特异性calpains表达及活性调节

目的研究褪黑素(melatonin)对长期接受己烯雌酚(DES)大鼠垂体非组织特异性calpains表达及活性变化的影响。方法30只♀Wistar大鼠,实验分5组:组1:腹腔注射葵花油(1ml.kg-1,每周两次)共计16wk;组2:腹腔注射己烯雌酚(DES,5mg.kg-1,每周两次),共计16wk;组3:腹腔注射DES(5mg.kg-1,每周两次),连续12wk,之后停止给予DES至第16周结束;组4和组5:腹腔注射己烯雌酚溶液(1mg·kg-1,每周两次),连续16wk,并于实验第13周开始分别同时给予皮下注射褪黑素(0.25mg.d-1和1.0mg.d-1),至第16周结束。使用蛋白质印迹(Westernblot)法检测垂体组织μ-和m-calpains表达,采用酪蛋白酶谱法观察不同组别垂体组织胞质及膜成分中μ-和m-calpains的活性变化。结果长期给予DES垂体组织μ-和m-calpain水平升高,膜成分活性增高,而停止给予DES或同时应用不同剂量褪黑素可不同程度降低μ-和m-calpain水平,抑制两种非组织特异性calpains的激活。结论长期给予♀性Wistar大鼠DES可使垂体组织中calpains表达及激活明显增高,并具有一定的雌激素依赖性。不同剂量的褪黑素可减少cal-pains表达,稳定胞质中calpains,抑制其转膜激活。