脾蒂血管束法构建工程化肝组织

目的 通过在脾蒂血管束内注射工程化肝组织凝胶,探讨一种体内植入较大尺度组织工程化肝脏的新方法.方法 2×107新生大鼠肝细胞与1ml生物蛋白胶混合构建工程化肝组织凝胶.切除SD大鼠的脾脏,并远端结扎、近端套圈后形成血管束.将凝胶注入血管束内,形成体积≥1 cm3的球形组织;同法构建肝组织凝胶植入大腿皮下作为对照.术后2周行大体观察,组织切片苏木素-伊红(HE)染色.结果 皮下组残留组织块较小,直径(1.63±0.55) mm,其内血管组织少.实验组形成了较大的组织块,直径(7.33±2.40) mm,内有大量血管形成.结论 在脾蒂血管束内构建工程化肝组织可以形成血管化的较大尺度类肝组织.     

筛选适宜于构建工程化肝组织的凝胶材料支架

目的使用不同可注射性凝胶支架体外进行新生大鼠肝细胞立体培养,为后期体内植入筛选相容性较好的支架材料。方法使用胰酶冷消化法分离新生大鼠肝细胞。将肝细胞分别与纤维蛋白胶、壳聚糖凝胶、鼠尾胶原、透明质酸钠支架材料复合,形成工程化肝组织凝胶,接种于培养板中,并通过定期光镜来观察大鼠肝细胞,四唑盐（MTT）比色法评价细胞活性。溴甲酚绿法测上清白蛋白含量,脲酶比色法测定上清尿素含量。结果四组均可形成三维生长的工程化类肝样组织。培养第4天,生物蛋白胶及壳聚糖组的培养上清液中尿素含量达到高峰,分别为培养第1天的1.31倍和1.28倍,随后含量缓慢下降。培养第7天,新生大鼠肝细胞在纤维蛋白凝胶及壳聚糖凝胶中密集生长,同时MTT显示细胞活性及白蛋白分泌达到高峰,OD值分别为培养初期的1.11倍和1.17倍,上清白蛋白含量分别是初期的1.13倍和1.15倍。而在透明质酸钠及鼠尾胶原凝胶中则细胞生长缓慢,白蛋白及尿素含量持续下降。结论 4种可注射性支架中,壳聚糖和生物蛋白胶对于新生大鼠肝细胞生物相容性较好,透明质酸和鼠尾胶原较差,前两者更适合用于工程化肝组织的构建。     

基于肝门静脉注射肿瘤细胞的新型进展期肝脏肿瘤动物模型的建立

目的利用肝门静脉注射肿瘤细胞的方法,建立新型进展期肝脏肿瘤(肝细胞癌、结直肠癌肝转移、乳腺癌肝转移以及非小细胞肺癌肝转移)的动物模型。方法培养获得人肝细胞癌MHCC97-H、人结直肠癌SW480、人非小细胞肺癌A549以及人三阴性乳腺癌MDA-MB-231等细胞系,将这些恶性肿瘤细胞经由BALB/c裸小鼠肝门静脉注入肝脏,经3~4周生长后进行PET/CT检测:尾静脉注射约200μCi核素探针18F-FDG,30~40 min后对BALB/c裸小鼠进行PET/CT检测。在此基础上,收集动物获取肝脏进行拍照,确定BALB/c裸小鼠肝脏上的肿瘤病灶。结果 MHCC97-H、SW480、A549以及MDA-MB-231等细胞均能够在BALB/c裸小鼠肝脏形成多发、弥散的肿瘤病灶。肿瘤细胞在裸小鼠肝脏原位的生长可以使用PET/CT检测。SW480、MDA-MB-231以及A549细胞形成的病灶,其PET/CT检测信号弱于MHCC97-H细胞。结论成功获得了新型进展期肝脏肿瘤动物模型,为进展期肝脏肿瘤相关药物筛选奠定了坚实基础。     

筛选适宜于构建工程化肝组织的凝胶材料支架

目的使用不同可注射性凝胶支架体外进行新生大鼠肝细胞立体培养,为后期体内植入筛选相容性较好的支架材料。方法使用胰酶冷消化法分离新生大鼠肝细胞。将肝细胞分别与纤维蛋白胶、壳聚糖凝胶、鼠尾胶原、透明质酸钠支架材料复合,形成工程化肝组织凝胶,接种于培养板中,并通过定期光镜来观察大鼠肝细胞,四唑盐(MTT)比色法评价细胞活性。溴甲酚绿法测上清白蛋白含量,脲酶比色法测定上清尿素含量。结果四组均可形成三维生长的工程化类肝样组织。培养第4天,生物蛋白胶及壳聚糖组的培养上清液中尿素含量达到高峰,分别为培养第1天的1.31倍和1.28倍,随后含量缓慢下降。培养第7天,新生大鼠肝细胞在纤维蛋白凝胶及壳聚糖凝胶中密集生长,同时MTT显示细胞活性及白蛋白分泌达到高峰,OD值分别为培养初期的1.11倍和1.17倍,上清白蛋白含量分别是初期的1.13倍和1.15倍。而在透明质酸钠及鼠尾胶原凝胶中则细胞生长缓慢,白蛋白及尿素含量持续下降。结论 4种可注射性支架中,壳聚糖和生物蛋白胶对于新生大鼠肝细胞生物相容性较好,透明质酸和鼠尾胶原较差,前两者更适合用于工程化肝组织的构建。     

微卫星DNA标记对BABL/c突变卷毛小鼠遗传特性的分析

目的利用微卫星DNA标记技术对BALB/c突变卷毛小鼠与正常BALB/c小鼠进行遗传检测,旨在分析BALB/c突变卷毛小鼠与正常小鼠之间存在的遗传差异。方法选取38个微卫星DNA位点结合荧光PCR技术和STR扫描基因型来检测BALB/c突变卷毛小鼠、无毛小鼠与正常小鼠三个群体的遗传变异情况。结果 38个微卫星位点在BALB/c突变卷毛小鼠与正常小鼠之间有27个微卫星位点相同,有11个位点存在差异,其突变率为28.9%(11/38);BABL/c突变无毛小鼠与正常小鼠之间有30个位点完全相同,8个位点存在差异,其突变率为21.1%(8/38);而BABL/c突变卷毛小鼠与无毛小鼠间也有12个位点存在差异。结论 BALB/c突变卷毛小鼠的突变率较高,且明显高于无毛小鼠,证明了卷毛小鼠突变与无毛小鼠突变是两个完全不同的突变系,为今后研究和开发应用BALB/c突变卷毛小鼠提供可靠的理论数据。     

小鼠肝癌H22细胞不同乙醛脱氢酶表达亚群的致瘤性分析

[目的]利用干细胞中乙醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase,ALDH)高表达的特性,分选小鼠肝癌H22细胞中ALDH表达不同的亚群,分析细胞球体形成与致瘤性,为针对肿瘤干粗细胞的肿瘤靶向治疗奠定基础.[方法]流式细胞术分选小鼠肝癌H22细胞的ALDH阳性、弱阳性和阴性细胞亚群;将分选出的各亚群细胞,在于细胞培养基中培养,观察球体形成;将各亚群细胞分别以不同数量级在小鼠背部皮下注射致瘤,观察成瘤情况,绘制生长曲线.[结果](1)小鼠H22细胞可分选出ALDHhigh,ALDHlow,ALDHneg3个亚群细胞.(2)ALDHhigh亚群细胞可形成细胞球体,ALDHlow和ALDHneg亚群细胞不能形成球体.(3)ALDHlow亚群在接种2×102个细胞和2×104个细胞时,肿瘤的生长趋势和平均体积均高于其它2个亚群.[结论]H22细胞中ALDHhigh亚群ALDH表达阳性且可以形成球体,符合干细胞特征;ALDHlow亚群呈ALDH弱表达,体外培养不能形成球体,但致瘤性高于ALDHhigh和ALDHneg亚群细胞,是出现分化并进入快速增殖状态的亚群,可能是在肿瘤生长与复发中具有重要意义的肿瘤祖细胞,应成为肿瘤治疗的重要标靶.     

多聚甲醛固定对流式细胞术检测人外周血淋巴细胞亚群的影响

摘要：目的?考察多聚甲醛(PFA)浓度和固定时间对流式细胞术检测人外周血T、B、NK淋巴细胞亚群百分比和平均荧光强度的影响。方法?以健康人外周血为研究对象,将六色荧光抗体标记后溶血处理的细胞分别用PBS、1% PFA(10 g/L)和4% PFA(40 g/L)进行重悬或固定,用流式细胞仪在固定0、4、8、12、24、48和72 h后检测CD19-CD3+T、CD3+CD4+T、CD3+CD8+T、CD3-CD19+B、CD3-CD56+NK细胞占淋巴细胞百分比,及CD45、CD3、CD4、CD8、CD19、CD56的平均荧光强度。结果?与PBS对照组相比,72 h内,PFA浓度及固定时间对外周血T、B、NK淋巴细胞亚群百分比均没有影响(P均>0.05);固定8 h内,PBS对各淋巴细胞亚群平均荧光强度均无影响,1% PFA组CD4平均荧光强度下降,4% PFA组CD45、CD3、CD4、CD8平均荧光强度均下降;固定24 h后,各淋巴细胞亚群平均荧光强度均下降,同时4% PFA固定后平均荧光强度均低于1% PFA(P<0.05)。结论?使用流式细胞术检测人外周血淋巴细胞亚群,细胞染色后若8 h内检测用PBS进行细胞重悬检测效果最好,PFA固定不应超过12 h,1% PFA固定效果优于4% PFA。     

进展期肝细胞癌分子靶向药物治疗疗效预测动物模型的建立

目的建立肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)分子靶向治疗药物药效学检验与预测模型。方法本次实验选择了MHCC97-H细胞(高侵袭性的HCC细胞系)建立了裸鼠皮下肿瘤模型、肝脏原位接种HCC组织模型、肝门静脉注射HCC细胞模型;选取分子靶向药物索拉非尼(sorafenib)、阿帕替尼(apatinib)以及安罗替尼(anlotinib)为模式药物;裸鼠灌胃给予2 mg·kg^-1的索拉非尼、阿帕替尼以及安罗替尼进行治疗后,确定这些分子靶向药物对不同肿瘤模型的抗肿瘤作用,计算药物抑制肿瘤细胞生长的抑制率。结果索拉非尼、阿帕替尼以及安罗替尼均能够显著抑制不同模型中MHCC97-H细胞的生长,阿帕替尼以及安罗替尼的作用较优于索拉非尼。结论本实验成功建立了分子靶向药物治疗进展期肝细胞癌疗效预测动物模型。     

术前Glasgow预后分数与直肠癌肝转移和预后的关系探讨

目的探讨术前Glasgow预后分数（Glasgow prognostic score,GPS）与直肠癌肝转移和预后的关系。方法回顾性分析中国人民解放军总医院普通外科2005年6月至2011年12月期间收治并行手术治疗的223例直肠癌患者的临床资料,分析术前GPS得分与直肠癌肝转移和预后的关系。结果直肠癌术前GPS得分与肿瘤的浸润深度（P〈0.001）、脉管浸润（P〈0.001）、肝转移（P〈0.001）、TNM分期（P〈0.001）、癌胚抗原水平（P=0.009）、CA19-9水平（P〈0.001）及CA724水平（P〈0.001）均有关。肿瘤分化程度（低分化：OR=10.688）、脉管浸润（OR=4.918）、淋巴结转移（OR=3.359）及术前GPS得分（2分：OR=15.907）是直肠癌肝转移的影响因素;年龄（RR=2.121）、分化程度（低分化：RR=2.846）、浸润深度（RR=1.754）、TNM分期（Ⅱ期：RR=7.447,Ⅲ期：RR=9.030,Ⅳ期：RR=13.325）及术前GPS得分（2分：RR=2.471）是直肠癌预后的独立危险因素。术前GPS得分与直肠癌肝转移和预后均有关。结论术前GPS得分与直肠癌肝转移相关,且其可作为直肠癌预后评估的参考指标。     

工程化肝组织肝表面片状植入新方法

目的 探索较大尺度工程化肝组织原位肝表面贴覆片状植入、尽快建立血供的可行性.方法 将采用胰酶冷消化法分离的新生大鼠肝细胞(1×1010个/L)、肺组织块贴壁法分离的大鼠微血管内皮细胞(1 ×1010个/L),与片状胶原支架、血管内皮生长因子(VEGF,10g/L)复合构建肝细胞/内皮细胞/血管生长因子/胶原支架复合的片状工程化肝组织.将其在15只大鼠肝表面贴覆植入,4周后取样进行大体观察及组织切片苏木素-伊红(HE)染色.结果 分离的肝细胞及内皮细胞活率均为90％以上.片状工程化肝组织经肝表面贴覆法植入后,大体观察可见能与原位肝脏紧密贴合生长,形成体积大于1 cm3的类肝样组织.体内植入后4周,植入物与肝脏贴合紧密,融合生长.组织学观察显示移植物中肝细胞均匀分布,未见细胞变性及死亡,有血管生成.结论 肝表面贴覆植入法简便安全,可构建较大尺寸的工程化肝组织,有望达到原位修复受损肝脏的目的.