大鼠青春期前期睾丸E 型钙黏蛋白的表达变化

目的 研究E 型钙黏蛋白(CDH1)在大鼠青春期前期睾丸组织中特异的时空表达模式.方法 利用RT-PCR 半定量检测和免疫组织化学染色分别研究CDH1 转录水平和蛋白表达变化特点.结果 CDH1 mRNA 的表达呈现明显的年龄依赖性.CDH1 mRNA 表达水平在出生后第2、4、6天保持较高的水平.在出生后第8 天突然下降,在出生后第10 天又开始升高,然后从第12 ～30 天逐渐降低.免疫组织化学染色结果显示:在大鼠出生后第2 ～30 天CDH1 均有表达,其中第2 ～10 天表达较强,第12 ～30 天表达逐渐减弱.结论 CDH1 在大鼠早期精子发生过程呈现特定的时空表达模式,对精子发生起着极其重要的作用.     

大鼠发育第6天与第8天睾丸组织基因表达差异的分析

目的 检测大鼠精原干细胞早期发育过程中第6天与第8天睾丸组织的差异表达基因.方法 通过基因芯片技术,利用Roche-NimbleGen公司大鼠12×135K全基因组表达谱芯片分别与第6天和第8天睾丸组织的cDNA进行杂交.比较两个样品差异表达的基因.结果 差异表达基因700个,表达上调的基因共295个,表达下调的基因共405个.参与了1 407个基因功能分析条目;参与了46个生物学通路.结论 大鼠精原干细胞早期发育过程中,精原干细胞的发生与增殖是一个多基因参与、多因素作用和多阶段进展的过程.     

Expression of Interleukin-6 in Mouse Uterus during Pregnancy

ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＩｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－６ｉｎＭｏｕｓｅＵｔｅｒｕｓｄｕｒｉｎｇＰｒｅｇｎａｎｃｙ￥（刘承权，吴应积，胡炎）ＬｉｕＣｈｅｎｇ－ｑｕａｎ；ＷｕＹｉｎ－ｇｉ；（ＺｈｏｎｇｓｈａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ，５１０２７...     

大鼠曲细精管生殖细胞体外共培养和精子发生过程的观察

目的建立体外长期共培养体系和观察方法,为精子发生过程的研究提供细胞模型。方法采用大鼠曲细精管生殖细胞及支持细胞共培养的方法,对睾丸生精细胞作显微镜观察。结果共培养的支持细胞和生精细胞在体外存活超过6个月。在共培养期间,观察到精母细胞、圆形精子细胞和长形精子细胞。结论在不添加任何细胞因子和生长因子的情况下,大鼠曲细精管生殖细胞长期增生分化,不断产生精子细胞。这一结果暗示组织块和共生的支持细胞可为生殖细胞的增生和分化提供必需的细胞因子。该方法为体外研究精子发生过程提供了实验依据。     

卵黄囊移植人脐血CD34+细胞构建人源化血液系统小鼠模型

背景:与较为成功的羊等大型动物宫内移植方法相比,利用小鼠等小型动物宫内移植异种造血干细胞仍面临困境,在外周血内检测到的异种血液细胞重建率仍在1%以下。目的:观察小鼠卵黄囊移植人脐血来源CD34 造血干细胞后的异种造血重建效率,并与腹腔移植的效果进行比较。设计、时间及地点:细胞学体内移植实验,于2007-10在北京大学干细胞与再生生物学实验室完成。材料:健康新生儿脐血取自北京海淀区妇幼保健院。ICR小鼠由北京大学医学部实验动物中心提供,孕8.5d鼠8只,孕12.5d鼠9只。藻红蛋白标记的抗人CD45单克隆抗体与流式细胞仪均为BD公司产品。方法:采用Ficol1法梯度离心获得人脐血单个核细胞,经磁珠分选系统纯化获得CD34 细胞。将孕8.5d鼠麻醉后,打开腹腔并暴露子宫,显微镜下抽取5~10μL脐血CD34 细胞(5×104个),缓慢注入胎鼠的卵黄囊中。相同操作条件下将等量脐血CD34 细胞注射到孕12.5d胎鼠的腹腔中。快速抽针,将孕鼠子宫归位并缝合腹腔,继续妊娠,等待分娩。待小鼠出生后3个月,经尾静脉取血,在避光状态下加入藻红蛋白标记的抗人CD45单克隆荧光抗体,流式细胞仪检测血细胞表面标记CD45的表达,通过其阳性率判断人血液细胞在小鼠体内的重建效果。主要观察指标:不同移植方式对小鼠造血重建的影响。结果:CD34 细胞通过卵黄囊移植方式共获得健康出生小鼠52只,3个月后86.5%(45/52)小鼠CD45呈阳性表达,嵌合率高达4.34%。通过腹腔移植方式共获得健康出生小鼠48只,3个月后81.3%(39/48)小鼠CD45呈阳性表达,明显低于卵黄囊移植方式(t=2.363,P<0.05)。结论:早期卵黄囊移植可以获得人造血干细胞在小鼠体内的长期重建,效果优于腹腔移植,同时也证明了通过胎鼠卵黄囊移植人脐血造血干细胞取得人源化造血系统小鼠模型的可行性。     

卵黄囊移植人脐血CD34+细胞构建人源化血液系统小鼠模型

背景：与较为成功的羊等大型动物宫内移植方法相比，利用小鼠等小型动物宫内移植异种造血干细胞仍面临困境，在外周血内检测到的异种血液细胞重建率仍在1%以下。 目的：观察小鼠卵黄囊移植人脐血来源CD34+造血干细胞后的异种造血重建效率，并与腹腔移植的效果进行比较。 设计、时间及地点：细胞学体内移植实验，于2007-10在北京大学干细胞与再生生物学实验室完成。 材料：健康新生儿脐血取自北京海淀区妇幼保健院。ICR小鼠由北京大学医学部实验动物中心提供，孕8.5 d鼠8只，孕 12.5 d鼠9只。藻红蛋白标记的抗人CD45单克隆抗体与流式细胞仪均为BD公司产品。 方法：采用Ficol1法梯度离心获得人脐血单个核细胞，经磁珠分选系统纯化获得CD34+细胞。将孕8.5 d鼠麻醉后，打开腹腔并暴露子宫，显微镜下抽取5~10 μL脐血CD34+细胞（5×104个），缓慢注入胎鼠的卵黄囊中。相同操作条件下将等量脐血CD34+细胞注射到孕12.5 d胎鼠的腹腔中。快速抽针，将孕鼠子宫归位并缝合腹腔，继续妊娠，等待分娩。待小鼠出生后3个月，经尾静脉取血，在避光状态下加入藻红蛋白标记的抗人CD45单克隆荧光抗体，流式细胞仪检测血细胞表面标记CD45的表达，通过其阳性率判断人血液细胞在小鼠体内的重建效果。 主要观察指标：不同移植方式对小鼠造血重建的影响。 结果：CD34+细胞通过卵黄囊移植方式共获得健康出生小鼠52只，3个月后86.5%（45/52）小鼠CD45呈阳性表达，嵌合率高达4.34%。通过腹腔移植方式共获得健康出生小鼠48只，3个月后81.3%（39/48）小鼠CD45呈阳性表达，明显低于卵黄囊移植方式（t=2.363, P < 0.05）。 结论：早期卵黄囊移植可以获得人造血干细胞在小鼠体内的长期重建，效果优于腹腔移植，同时也证明了通过胎鼠卵黄囊移植人脐血造血干细胞取得人源化造血系统小鼠模型的可行性。     

食蟹猴精原干细胞分离纯化及鉴定

目的掌握食蟹猴精原干细胞 (spermatogonial stem cells,SSCs) 体外培养生长特性,建立食蟹猴精原干细胞分离、纯化、培养及初步鉴定的方法。 方法经手术获取2岁14天食蟹雄猴单侧睾丸,采用三步酶消化法分离获得单细胞悬液和差异贴壁法富集精原干细胞。将细胞培养于经丝裂酶素C处理的STO细胞层上,使用添加神经胶质细胞源性的神经营养因子(GDNF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、GDNF家族受体α (GFRa1) 三种重要生长因子的无血清培养液体外培养,20d后采用CDH1标记分子免疫荧光染色和RT-PCR对培养的食蟹猴细胞进行SSCs初步鉴定。 结果通过差异贴壁法分离纯化富集的SSCs,接种到丝裂霉素C处理的STO饲养层细胞上,第2天开始分裂增殖。用含有生长因子的培养基培养2 d细胞形成小集落,5 d后细胞集落明显。培养20 d后,SSCs呈葡萄串状细胞簇,符合SSCs的形态特征,这些细胞经CDH1标记分子免疫荧光染色和RT-PCR均呈阳性表达。 结论本研究成功建立食蟹猴精原干细胞的分离纯化及鉴定体系。基于STO饲养细胞的添加GDNF、bFGF和GFRa1三种生长因子的无血清培养体系可用于食蟹猴精原干细胞培养,CDH1可作为食蟹猴精原干细胞鉴定的标志物。