骨髓间质干细胞移植在脑梗死大鼠脑内分化及对神经功能恢复的影响

背景：间质干细胞的多向潜能性研究目前多处于动物实验阶段，至不同定位组织后是否有向其组织分化并产生相应的功能?目的：观察骨髓间质干细胞移植于脑皮质缺血性梗死灶的周围，观察其向神经分化及其对神经功能恢复的作用。设计：随机对照实验。单位：中山大学基础医学院解剖教研室，中山大学附属第一医院神经内科，暨南大学医学院病理教研室，广州医学院医学检验系。材料：实验于2002-11／2003-11在中山大学医学院完成。选择清洁级雄性SD大鼠48只t，随机分为造模的梗死组32只和不造模的对照组16只。梗死组又随机分成移植组16只和磷酸盐缓冲液组16只；以前囟为参考点，尾侧3mm旁开1．5mm，深度2．0～3．0mm，分别移植5μL(5&;#215;10^4L^-1)间质干细胞或磷酸盐缓冲液。方法：从非血液系统疾病的胸外科手术中摘取的肋骨骨髓中分离、纯化而获得的间质干细胞，经体外培养、扩增、鉴定。各组大鼠在移植后第2，6周末麻醉，对标本移植部位进行25μm连续冰冻切片。用免疫组织化学方法检测神经元特异性烯醇化酶、神经丝蛋白、胶质纤维酸性蛋白、巢蛋白的表达，评估间质干细胞向神经元、神经胶质细胞分化的能力。随机抽取移植组8只大鼠，磷酸盐缓冲液组8只大鼠，在移植前和移植后2，6周末用横木行走试验评分法观察大鼠全身状态和反应能力。对照组16只大鼠与移植组和磷酸盐缓冲液组同时测评。主要观察指标：①大脑皮质神经元特异性烯醇化酶、神经丝蛋白、胶质纤维酸性蛋白、巢蛋白的表达。②横木行走试验评定大鼠运动功能。结果：48只大鼠全部进入结果分析。①第2周末移植间质干细胞位置可见胶质纤维酸性蛋白、巢蛋白表达呈现阳性。第6周末移植间质干细胞位置神经元特异性烯醇化酶、神经丝蛋白表达也呈出阳性。而磷酸盐缓冲液组相应注射部位神经元特异性烯醇化酶、神经丝蛋白、胶质纤维酸性蛋白、巢蛋白表达均为阴性。②对照组无明显神经症状，评分均为9分。移植2周后，移植组运动功能评分高于磷酸盐缓冲液组[(6．7&;#177;0．9)分，(5．3&;#177;1．0)分，(P&;lt;0．05)]。移植6周后，移植组运动功能评分也高于磷酸盐缓冲液组[(8．9&;#177;1．1)分，(7．2&;#177;0．8)分，(P&;lt;0．05)]。结论：骨髓间质干细胞移植后在中枢神经系统有趋向神经元和神经胶质细胞分化的能力，表达了某些神经元胶质细胞的特性。移植组大鼠横木行走试验运动功能评分高于磷酸盐缓冲液组，并显示出明显的神经功能修复作用。     

间质干细胞移植在大鼠缺血性脑卒中的实验研究

目的:探索间质干细胞移植在脑梗塞大鼠的脑内分化及促进神经功能的修复作用。方法:从健康人的肋骨骨髓中分离、纯化而获得的间质干细胞,经体外培养、扩增、鉴定的同时制造大脑中动脉皮层梗塞的实验动物模型;并且,在梗塞后10 d移植所鉴定的间质干细胞经免疫组化验证间质干细胞的脑内成活、及神经性分化后,在第2周和第6周进行神经功能评分。结果:间质干细胞在梗塞灶周边向神经元和神经胶质细胞的方向分化;移植的神经功能评分,修复作用与对照组有显著差异。结论:人间质干细胞为脑梗塞治疗提供了新的思路。     

MicroRNA-196a通过HOXB7调控人骨髓间充质干细胞的增殖功能

 目的:研究年龄相关microRNA-196a (miR-196a) 对人骨髓间充质干细胞（hMSCs）增殖功能的调控作用。方法:通过MTT研究年龄对hMSCs增殖能力的影响。通过microRNA芯片和qRT-PCR检测年龄对miR-196a表达的影响。通过转染miR-196a模拟物或抑制物,研究其对hMSCs增殖能力的影响。通过萤光素酶报告基因系统证实HOXB7为miR-196a的靶基因。通过siRNA研究HOXB7对碱性成纤维细胞生f长因子(bFGF)表达及hMSCs增殖功能的影响和研究bFGF对hMSCs增殖功能的影响。结果:随年龄增加,hMSCs的增殖能力下降,miR-196a的表达增加。miR-196a可抑制hMSCs的增殖。抑制miR-196a的表达可促进hMSCs的增殖。同时抑制miR-196a和HOXB7的表达,使miR-196a失去对hMSCs增殖能力的调控作用。抑制HOXB7的表达可使bFGF的表达下调。直接抑制HOXB7或bFGF的表达可抑制hMSCs的增殖。结论:miR-196a通过抑制HOXB7及bFGF的表达导致hMSCs增殖能力下降。     

葛根素对RAW264.7源性泡沫细胞胆固醇摄取及外排功能的影响

目的:探讨葛根素(puerarin,Pur)对RAW264.7源性泡沫细胞胆固醇摄取及外排功能的影响。方法:以氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL)诱导RAW264.7源性泡沫细胞。细胞经处理后,利用荧光探针Di I-ox-LDL检测泡沫细胞摄取ox-LDL的能力,NBD标记胆固醇外排实验检测泡沫细胞的胆固醇外排功能,Western blot法检测LC3II、P62、CD36、ATP结合盒转运蛋白A1(ATP-binding cassette transporter A1,ABCA1)、溶酶体酸性脂肪酶(lysosomal acid lipase,LAL)以及p-AMPK的蛋白水平。结果:RAW264.7源性泡沫细胞经Pur处理后胆固醇摄取减少、胞内胆固醇外排增加并且自噬相关蛋白LC3II表达增加,P62表达减少,脂质吸收相关蛋白CD36表达减少,胆固醇外排相关蛋白ABCA1和LAL表达增加,其变化与自噬激动剂雷帕霉素处理后改变类似。Pur与自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤共处理后,胆固醇摄取增加、胆固醇外排功能减弱,并且ABCA1、LAL和p-AMPK的蛋白水平减少,但CD36表达未有明显改变。结论:Pur可使得泡沫细胞LAL和ABCA1介导的胆固醇外排能力有所增强,其机制可能是通过AMPK通路增强自噬对胆固醇外排的调控;又可通过对CD36负向调节而使得泡沫细胞对脂质的摄取减少。     

肝内胆管的应用解剖与肝内胆管结石手术入路的研究

目的 探讨肝内叶、段胆管的解剖结构及肝内胆管结石的手术入路。方法 通过研究12例成人肝脏标本的肝内胆管与血管的位置、毗邻关系,设计出经肝的脏面显露左右肝管,经肝的膈面显露肝内叶、段胆管相对合的手术入路,并结合治疗56例复杂性肝内胆管结石患者。结果 左右肝管均位于肝脏脏面门静脉左右干的前上缘;左内叶、右前叶胆管位于相应门静脉的前内侧。右后叶胆管位于门静脉右前支或右前叶下段支脏面测侧者占66.7％(8/12);位于门静脉右后支脏面深侧或后上缘者占83.3％(10/12)。左外叶胆管位于门静脉矢状部脏面深侧者占91.7％(11/12)。选择经肝的脏面显露左右肝管,经肝的膈面显露肝内叶、段胆管相结合的手术入路,治疗复杂性肝内胆管结石患者56例,临床疗效满意。结论 选择经肝的脏面与膈面相结合的手术方式,较易取出结石。     

大鼠脑梗塞后功能恢复过程中Nogo-A mRNA及其蛋白质的表达

目的：研究神经生长抑制因子Nogo-A mRNA 在大鼠缺血性脑梗塞脑内不同时点表达的变化与功能恢复的关系，探讨Nogo-A基因在缺血性脑梗塞中神经再生的作用。 方法： 建立缺血性脑梗塞（MCAO）模型,采用原位杂交法结合Western免疫印迹技术、功能评分,检测80只在不同时期缺血性脑梗塞大鼠脑内Nogo-A的表达量及其与功能恢复的关系。 结果： 原位杂交法显示：Nogo-A mRNA在脑梗塞后3 d下降，7 d后上升，2周达到高峰，第3、4周保持第2周水平；Western免疫印迹显示：Nogo-A含量在脑梗塞后3 d下降，7 d后上升，3周达到高峰，第4周保持第3周水平。功能评分显示：在梗塞过程功能评分随时间推迟而升高，3周达到高峰, 第4周保持第3周水平。 结论： Nogo-A的转录及蛋白表达与大脑中动脉梗塞后脑卒中的功能恢复可能关系密切。     

神经生长抑制因子Nogo-A在缺血性脑梗塞大鼠脑组织中的表达

目的：研究神经生长抑制因子Nogo-A mRNA 在大鼠缺血性脑梗塞脑内不同时点表达的变化，探讨 Nogo-A基因在缺血性脑梗塞时神经再生的作用。 方法： 建立缺血性脑梗塞（MCAO）模型,采用原位杂交法结合免疫组化技术,检测80只在不同时期缺血性脑梗塞大鼠脑内Nogo-A 的表达量。 结果： 原位杂交法显示：Nogo-A mRNA在脑梗塞后3 d下降，7 d后上升，2周达到高峰，第3、4周保持第2周水平；免疫组化显示：Nogo-A含量在脑梗塞后3 d下降，7 d后上升，3周达到高峰，第4周保持第3周水平。 结论： 脑内Nogo-A 表达在脑梗塞急性期(3 d)变化不明显，而在1周后较为明显，表明：在脑梗塞后期Nogo-A 表达有明显升高，它可能是造成成年哺乳动物损伤后神经再生障碍的重要原因之一。     

骨髓间质干细胞移植在脑梗死大鼠脑内分化及对神经功能恢复的影响

背景间质干细胞的多向潜能性研究目前多处于动物实验阶段,至不同定位组织后是否有向其组织分化并产生相应的功能?目的观察骨髓间质干细胞移植于脑皮质缺血性梗死灶的周围,观察其向神经分化及其对神经功能恢复的作用.设计随机对照实验.单位中山大学基础医学院解剖教研室,中山大学附属第一医院神经内科,暨南大学医学院病理教研室,广州医学院医学检验系.材料实验于2002-11/2003-11在中山大学医学院完成.选择清洁级雄性SD大鼠48只,随机分为造模的梗死组32只和不造模的对照组16只.梗死组又随机分成移植组16只和磷酸盐缓冲液组16只;以前囟为参考点,尾侧3 mm旁开1.5 mm,深度2.0～3.0 mm,分别移植5 μL(5×104 L-1)间质干细胞或磷酸盐缓冲液.方法从非血液系统疾病的胸外科手术中摘取的肋骨骨髓中分离、纯化而获得的间质干细胞,经体外培养、扩增、鉴定.各组大鼠在移植后第2,6周末麻醉,对标本移植部位进行25 μm连续冰冻切片.用免疫组织化学方法检测神经元特异性烯醇化酶、神经丝蛋白、胶质纤维酸性蛋白、巢蛋白的表达,评估间质干细胞向神经元、神经胶质细胞分化的能力.随机抽取移植组8只大鼠,磷酸盐缓冲液组8只大鼠,在移植前和移植后2,6周末用横木行走试验评分法观察大鼠全身状态和反应能力,对照组16只大鼠与移植组和磷酸盐缓冲液组同时测评.主要观察指标①大脑皮质神经元特异性烯醇化酶、神经丝蛋白、胶质纤维酸性蛋白、巢蛋白的表达.②横木行走试验评定大鼠运动功能.结果48只大鼠全部进入结果分析.①第2周末移植间质干细胞位置可见胶质纤维酸性蛋白、巢蛋白表达呈现阳性.第6周末移植间质干细胞位置神经元特异性烯醇化酶、神经丝蛋白表达也呈出阳性.而磷酸盐缓冲液组相应注射部位神经元特异性烯醇化酶、神经丝蛋白、胶质纤维酸性蛋白、巢蛋白表达均为阴性.②对照组无明显神经症状,评分均为9分.移植2周后,移植组运动功能评分高于磷酸盐缓冲液组[(6.7±0.9)分,(5.3±1.0)分,(P＜0.05)].移植6周后,移植组运动功能评分也高于磷酸盐缓冲液组[(8.9±1.1)分,(7.2±0.8)分,(P＜0.05)].结论骨髓间质干细胞移植后在中枢神经系统有趋向神经元和神经胶质细胞分化的能力,表达了某些神经元胶质细胞的特性.移植组大鼠横木行走试验运动功能评分高于磷酸盐缓冲液组,并显示出明显的神经功能修复作用.     

人脾脏树突状细胞的分离纯化与鉴定

目的　建立人脾脏体外培养树突状细胞的新方法。方法　人脾脏细胞悬液培养 2h后获得贴壁的单核细胞 ,加入重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 (rhGMCSF) 10 0 μg/L或rhGMCSF 10 0 μg/L +重组人白细胞介素 4 (rhIL 4 ) 5 0 0k/L ,体外培养 1周 ,收集悬浮细胞 ,以流式细胞仪分析细胞表型及抗原内吞能力 ,alloMLR检测细胞抗原呈递功能。结果　以细胞因子培养 7d生成的悬浮细胞 ,2 0 %～ 80 %表达树突状细胞特异性标志CD1a ,表达高水平的MHC Ⅱ、B71、B72分子 ,具有较强的抗原内吞能力 ,抗原内吞能力及T淋巴细胞活性与人外周血单核细胞培养获得的DC相似。结论　从人脾脏获得的贴壁的单核细胞 ,体外以rhGMCSF +rhIL 4培养 ,可以获得极其大量的树突状细胞