心脏组织特异性表达Cre重组酶转基因小鼠的建立

目的：建立在小鼠心肌细胞中特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠。方法：构建了心肌细胞特异性表达Cre重组酶的转基因载体。该载体通过显微注射被导入小鼠受精卵中，通过胚胎移植，获得转基因首建者小鼠。利用PCR检测子代小鼠Cre重组酶整合情况。通过Northern杂交检测Cre重组酶表达的组织特异性。结果：构建了含有心肌细胞特异性α-肌球蛋白重链(α-MHC)启动子、Cre重组酶基因和人生长激素基因polyA的转基因载体α-MHC—Cre—hGH。将转基因载体进行显微注射，共注射了215枚小鼠受精卵，其中202枚移植入13只假孕母鼠的输卵管中发育，获得子代小鼠42只。PCR检测发现有1只小鼠在其基因组上整合有Cre重组酶基因。Northem杂交检测结果显示该转基因小鼠只在心脏组织中特异性地表达Cre重组酶基因。结论：成功获得了在小鼠心肌细胞中特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠，为利用条件基因打靶技术研究基因在心脏发育与相关疾病中的功能提供了有利的工具。     

Smad3基因缺失加快的小鼠皮肤创面收缩速度机制研究

目的:研究Smad3基因剔除小鼠皮肤创伤愈合速度加快的机制。方法:利用不同基因型的Smad3基因剔除小鼠及对照小鼠进行皮肤缺失型创伤试验,观察组织病理变化;分离不同基因型小鼠胚胎成纤维细胞,观察其胶原收缩能力的变化。结果:Smad3基因剔除小鼠在皮肤创伤愈合时表现出重上皮化进度快;成纤维细胞胶原收缩试验中,Smad3缺失的细胞在有血清的培养条件下胶原收缩速度快于野生型细胞,而在无血清培养条件下,有无转化生长因子β1(TGF-β1)两者变化不显著。有血清培养时Smad3缺失的成纤维细胞表达α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)增加。结论:SMAD3通过抑制α平滑肌肌动蛋白在成纤维细胞中的表达调节成纤维细胞的收缩能力,以致Smad3缺失小鼠皮肤创面收缩速度加快。     

Smad3基因缺失加快的小鼠皮肤创面收缩速度机制研究

目的：研究Smad3基因剔除小鼠皮肤创伤愈合速度加快的机制。方法：利用不同基因型的Smad3基因剔除小鼠及对照小鼠进行皮肤缺失型创伤试验，观察组织病理变化；分离不同基因型小鼠胚胎成纤维细胞，观察其胶原收缩能力的变化。结果：Smad3基因剔除小鼠在皮肤创伤愈合时表现出重上皮化进度快；成纤维细胞胶原收缩试验中，Smad3缺失的细胞在有血清的培养条件下胶原收缩速度快于野生型细胞。而在无血清培养条件下，有无转化生长因子β1(TGF-β1)两者变化不显著。有血清培养时Smad3缺失的成纤维细胞表达α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)增加。结论：SMAD3通过抑制α平滑肌肌动蛋白在成纤维细胞中的表达调节成纤维细胞的收缩能力，以致Smad3缺失小鼠皮肤创面收缩速度加快。     

肝细胞特异性表达Cre重组酶转基因小鼠的建立

目的 构建在小鼠肝细胞中特异表达Cre重组酶的转基因小鼠。方法 利用聚合酶链反应(PCR)获得小鼠肝细胞特异性启动子——白蛋白启动子，指导Cre重组酶在肝细胞中特异表达。通过受精卵显微注射的方法，将转基因载体导入小鼠受精卯中，获得转基因小鼠。利用逆转录聚合酶链反应(RT～PCR)检测转基因小鼠中Cre重组酶转录的组织特异性，并将转基因小鼠与Smad4条件基因打靶小鼠进行杂交，利用PCR和Southern Blot进一步检测Cre重组酶在小鼠体内表达的组织特异性及其介导lox P位点之间发生重组的活性。结果 获得了白蛋白启动子，构建了转基因载体pAlb-Cre。将转基因载体进行显微注射，共注射了837枚小鼠受精卵。PCR检测显示53只子代小鼠中有7只整合了Cre重组酶基因，Southern杂交结果证实共获得6只基因组上整合Cre重组酶基因的首建者小鼠。RT—PCR结果表明其中3只阳性小鼠的子代鼠在肝脏和睾丸中正确转录了外源基因。将在肝脏和睾丸中正确转录了外源基因的两只阳性鼠与Smad4条件基因打靶的小鼠杂交，通过PCR检测发现Cre转基因与Smad4条件基因打靶双阳性的子代鼠在肝脏中特异表达Cre重组酶，并能介导基因组中loxP序列间的基因重组，此结果通过Southern杂交得到了进一步证实。结论 成功构建了在小鼠肝细胞中特异表达Cre重组酶的转基因小鼠，为利用条件基因打靶技术研究基因在肝脏发育及相关疾病中的功能及机制奠定了基础。