采用全基因组测序技术快速诊断危重症新生儿的临床实践

目的 探索全基因组测序在危重症新生儿临床快速诊断中的应用。方法 前瞻性纳入2019年8—9月复旦大学附属儿科医院新生儿重症监护病房中进行核心家系全基因组测序的危重症患儿。结合测序数据和患儿的临床特征,分析患儿基因检测结果、临床转归。结果 共检测15例患儿,男9例,女6例。主要入院原因为呼吸异常7例,反应差、喂养困难各2例,发热、低体温、早产、抽搐各1例。全基因组测序平均检测周期为4.5 d。最终,3例患儿获得基因诊断,诊断阳性率为20%(3/15)。其中,2例患儿因病情较重,父母放弃治疗;1例患儿于送检样本当日死亡,基因检测结果可解释病因。结论 全基因组测序技术可为临床怀疑遗传性疾病的危重症新生儿提供及时有效的诊断,为临床处置危重症病例提供遗传学依据。[中国当代儿科杂志,2023,25 (2):135-139]     

新生儿重症监护病房新生儿耳聋基因致病变异携带者筛查的横断面调查

背景：我国耳聋发病率高与耳聋基因致病变异的携带率高有关,目前缺乏对NICU新生儿耳聋基因致病变异携带者的筛查数据。 目的：调查NICU新生儿中耳聋基因GJB2 和SLC26A4致病变异的携带率。 设计：横断面研究。 方法：纳入2016年1月至2021年12月在复旦大学附属儿科医院NICU住院、入院日龄≤28 d,且出院前完成高通量测序的新生儿,排除生后耳聋相关基因诊断阳性者。从病历系统中截取患儿的性别、胎龄、出生体重;从测序数据库中提取GJB2 基因和SLC26A4基因的检测结果、患儿人类表型标准用语信息。携带率（%）=杂合致病或可能致病（P/LP）变异例数/总研究对象人数。检索PubMed、Embase和万方数据库,纳入既往报道中国NICU人群、新生儿人群和孕妇人群中GJB2 基因和/或SLC26A4基因P/LP变异携带情况的文献,并行复习。 主要结局指标：GJB2 基因和SLC26A4基因的P/LP变异携带率。 结果：纳入14 924例新生儿,男8 587例（57.5%）,女6 337例,胎龄（35.6±3.7）周,出生体重（2 711.7±887.1）g。携带GJB2 基因P/LP变异的患儿2 009例（13.462%）,共检出18种杂合P/LP变异,其中c.109G>A最常见（10.902%）,其次为c.235del（1.749%）、c.299_300del（0.409%）、c.176_191del（0.154%）、c.508_511dup（0.074%）和c.257C>G（0.034%）。携带SLC26A4基因P/LP变异的患儿305例（2.044%）,共检出31种杂合P/LP变异,携带率最高的6种依次为c.919-2A>G（1.139%）、c.2168A>G（0.181%）、c.1226G>A（0.100%）、c.1229C>T（0.094%）、c.1174A>T（0.080%）和c.1003T>C（0.047%）。 结论：建议将GJB2 基因上的c.109G>A、c.508_511dup和c.257C>G以及SLC26A4基因的c.1003T>C位点纳入NICU新生儿耳聋基因致病变异携带者筛查。     

基于单中心儿童样本库人群全外显子组数据的致病突变携带者分析

目的 通过对比公共数据库和复旦大学附属儿科医院分子诊断中心（复旦儿科）样本库全外显子组测序（WES）数据中已知儿童致病突变频率差异,推测中国人群隐性遗传致病基因携带者频率分布。方法 整理公共数据库（OMIM、ClinVar、HGMD）中常染色体隐性遗传病的致病基因和突变位点,计算复旦儿科样本库中的WES数据,基于公共数据库的致病基因的携带者频率。结果 从公共数据库分析中共得到1 368个常染色体隐性致病基因上的60 209个位点。在复旦儿科1 147例临床WES样本中,共筛出408个基因上的1 016个突变位点。比较复旦儿科、人类外显子组整合数据库（ExAC）东亚（4 312例）和欧洲人群（33 301例）突变位点的出现频率,3个人群中均发现了人群特有的突变位点,相比ExAC欧洲人群,复旦儿科人群中的突变位点出现频率与ExAC东亚人群更为相近。在携带者频率>1%的基因中,复旦儿科和ExAC东亚人群相同的基因分别为70/81个（86.4%）和70/102个（68.6%）;复旦儿科和ExAC欧洲人群相同的基因分别为37/81个（45.7%）和37/136个（27.2%）。结论 通过与ExAC东亚和欧洲人群数据进行对比,中国人群中隐性致病基因及致病突变位点的携带者频率与ExAC东亚人群较为相似,与欧洲人群差异较大,建立针对中国人群特异性的常见遗传携带者突变位点筛查项目十分必要。     

复旦大学附属儿科医院高通量测序数据分析流程（第二版）对遗传疾病候选变异基因筛选用时和准确性分析

目的： 本研究旨在比较和分析复旦大学附属儿科医院（我院）分子诊断中心（本中心）2015年建立的高通量测序数据分析和临床诊断流程（复旦流程1.0）及其升级后的流程（复旦流程2.0）的临床应用效果。 方法：以复旦流程1.0和2.0对本中心新生儿重症监护病房送检行二代测序分子诊断的连续样本,进行初步数据分析结果、流程用时和准确性的比较和分析,并以典型病例具体说明复旦流程2.0的主要特点。 结果：2017年11月7~14日取得家属的知情同意的、行临床外显子检测的112例进入本文分析,初步数据分析结果的比较,进入人工数据审核的变异数量,复旦流程1.0平均210个,复旦流程2.0平均25个;完成112例从样本送达测序完成到初步报告形成时间,复旦流程1.0为78.8 h,复旦流程2.0为19.8 h;与人工审核后阳性结果判读符合率为63.6%（7/11）,阴性结果判读符合率为84.2%（85/101）。 结论：复旦流程2.0可以更加快速、准确和自动地进行大样本量的数据分析,可以用于临床大样本量的高通量数据分析及解读。     

复旦大学附属儿科医院高通量测序数据一体化全流程闭环分析系统及临床应用案例分析

背景：目前的临床遗传诊断中,外显子组捕获测序(ES)和全基因组测序(WGS)均有广泛的应用场景且在综合性价比和变异检测范围等方面各有优势;建立支持两种不同建库策略测序方案的整合性遗传诊断流程,是进一步提高遗传诊断敏感性和检测效率的关键。 目的整合ES以及WGS场景下的多变异类型分析、遗传病复杂临床表型的标准化与结构化、表型导向的遗传变异分析系统,建立从临床检测申请到遗传报告反馈的一体化流程。 设计：流程开发。 方法：(1)建立复旦大学附属儿科医院高通量测序数据一体化全流程闭环分析系统（复旦流程3.0）各个模块：①病史处理,②结构化遗传表型,③测序实验,④变异检测,⑤变异解读,⑥质控复核,⑦基因型表型联合分析。(2)代表性病例重测分析：根据结论性变异的类型和诊断难度选择代表性病例,展示代表性病例从病史处理开始到报告草稿为止各模块的运行情况。 主要结局指标：代表性病例分析过程中的结构化表型、数据质控、变异检测及解读、最终诊断。 结果：对3例代表性病例的重分析中,分别进行了经济版家系WGS、先证者WGS以及ES;病史成功提取结构化表型;FastQ及BAM文件结果数据质控良好;检测到的变异经解读之后进行基因型表型联合分析,分别检测出3例病例的复杂遗传模式。例1：ANTXR2基因点突变NM_058172:c.1294C>T与4q21.22 约13 kb的结构变异缺失形成隐性纯合致病;例2：线粒体MT ND6基因致病变异m.14459G>A,异质性>99.5%;例3：SMN1基因纯合致病变异NM_000344: c.863G>T合并SMN1基因单拷贝缺失。 结论：复旦流程3.0可整合ES和WGS数据,处理不同类型的变异结果,最终形成遗传诊断,且对复杂变异类型有高效处理能力。     

基于高通量测序技术的拷贝数变异筛选分析流程的建立及应用

目的 基于高通量测序的CNVs分析流程（PICNIC）与常规拷贝数变异微阵列比较基因组杂交检测方法的检测效率和结果分析。方法 纳入2016年1月1日至2017年12月31日复旦大学附属儿科医院分子诊断中心基于临床需要的、取得患儿家长知情同意的、同时送检了微阵列比较基因组杂交检测和高通量测序分析的病例。以微阵列比较基因组杂交为金标准，PICNIC为待测标准，微阵列比较基因组杂交检测采用安捷伦人类基因组CGH微阵列180K试剂盒，并经其软件进行数据处理和拷贝数变异检测。选择重复片段>500kb，缺失片段>200 kb 的CNVs 数据分析，经过筛选后，结合患儿表型人工进行结构评判，致病/可能致病（P/LP）为检测到的CNVs已知的表型与患儿表型相符合；临床意义未明（VUS）为检测到的CNVs已知的表型与患儿表型不完全相符合。PICNIC分析流程，从同一测序批次的BAM文件开始，经过外显子覆盖深度计算、质控筛选、CANOES计算CNVs评分并提供候选CNVs。后续从基因水平和区域水平二方面对CNVs进行注释和筛选。比较2种方法间检出率及其敏感性。结果 113例同时送检了微阵列比较基因组杂交检测和PICNIC测序分析流程，平均年龄2岁，发育迟缓82例，惊厥16例，孤独症5例，先天性心脏病3例，遗传咨询病例7例。微阵列比较基因组杂交检测到P/LP为76例，VUS为16例；PICNIC检测到P/LP为92例，VUS为21例；微阵列比较基因组杂交检测到的P/LP和VUS病例，均包含在PICNIC检测到的病例中，16例微阵列比较基因组杂交检测VUS结论的CNVs被PICNIC纳入P/LP，敏感度100%（95%CI: 94 %~100%），特异度100%（95%CI: 81%~100%），阳性预测值82.6%（95%CI: 73%~89），阴性预测值56.8%（95%CI: 40%~72%）。微阵列比较基因组杂交检测到的446个CNVs中，PICNIC也检测到190个，在PICNIC到的236个CNVs中，微阵列比较基因组杂交检测也检测到190个。结论 PICNIC分析流程对于P/LP的CNVs，具有100%的特异性和敏感性，可用于CNVs的临床检测。该方法的建立及临床推广对于进一步挖掘高通量捕获测序数据具有重要意义。     

ASPM基因缺陷致新生儿小头畸形6例病例系列报告并文献复习

背景：原发性小头畸形（MCPH）是以头围小、面部畸形和智力障碍为特征的神经系统发育性的罕见遗传性疾病。 目的：总结“新生儿基因组计划（China Neonatal Genomes Project,CNGP）”中ASPM基因缺陷导致原发性小头畸形（ASPM MCPH）病例的临床特征和基因变异特征,并对HGMD数据库收录的ASPM MCPH进行整理分析,加深对ASPM MCPH的认识。 设计：病例系列报告。 方法： 纳入参与CNGP且基因检测结果为携带ASPM双等位基因致病/可疑致病（P/LP）变异的患儿,整理患儿新生儿期的主要临床信息和基因检测结果。整理HGMD、ClinVar数据库及内部数据库ASPM基因P/LP变异,建立该基因P/LP变异列表,计算基因携带频率。分析HGMD数据库收录变异所属的文献,归纳ASPM MCPH表型和基因型关联性,进行统计学分析与比较。 主要结局指标：GNGP数据库ASPM基因致病变异携带率评估。 结果：携带ASPM基因双等位基因P/LP变异的患儿6例,共12个变异位点,其中6个变异为本研究首次报道。6例患儿产前B超均显示头围偏小,生后诊断小头畸形,但新生儿期其他表型不典型。CNGP患儿ASPM基因P/LP变异携带频率为0.001 206 403。既往报道中小头畸形、特殊面容和轻中度发育迟缓的表型占比＞50%,MR主要表现为脑回异常和脑室扩张;基因型中,无功能变异占96.43%,既往报道中失功能变异与错义变异对发育迟缓程度的影响差异无统计学意义。 结论：发现ASPM基因6个新的P/LP变异位点,首次提出ASPM基因致病变异NICU人群携带率评估,对产前检查提示头围偏小胎儿建议行基因检测。     

新生儿呼吸窘迫综合征并发支气管肺发育不良风险基因巢式病例对照研究

背景：既往已有许多针对支气管肺发育不良（BPD）风险基因的研究,但不同研究遗传表型差异大,无法作为呼吸窘迫综合征（RDS）并发BPD的遗传风险基因。 目的：筛选RDS并发BPD的遗传风险因素,明确其对RDS患儿预后的影响。 设计：巢式病例对照研究。 方法：以2016年1月1日至2021年8月1日在复旦大学附属儿科医院住院治疗、临床确诊RDS的患儿为队列人群,以是否并发BPD分为 BPD组和非BPD组。采用倾向性评分策略平衡2组胎龄,采用罕见变异关联性分析和功能富集分析,探索罕见变异基因富集的生物学过程,并筛选在BPD组中存在显著较多有害变异的候选风险基因。从GEO数据库检索RDS并发BPD高度相关基因表达数据,行基因表达模式的时间序列分析,验证本文高变异负荷基因的表达特征。 主要结局指标：RDS并发BPD风险基因。 结果：倾向性评分匹配后BPD组111例,非BPD组157例,2组的胎龄差异无统计学意义。基于2 742个背景基因显著富集的1 558个生物学过程（P<0.01）,蛋白质截断变异最显著富集的基因集与蛋白激酶活性有关（P=0.011）,BPD组中携带蛋白质截断变异的基因总数最多的是阳离子跨膜转运相关基因（P=0.027）。错义/非同义变异最显著富集的基因集与生长发育的调节有关（P=0.001）。BPD组中有26个基因的错义/非同义罕见变异负荷显著高于非BPD组（P<0.05）,其中3个基因（ARSB、B9D2和UVSSA）差异有统计学意义（P<0.01）。通过GEO数据库数据验证,ARSB在重度BPD中显著低表达（P<0.001）,时间序列分析发现ARSB基因在重度BPD新生儿中表达模式与无/轻度BPD新生儿差异有统计学意义（P<0.01）。 结论：ARSB基因为RDS并发BPD的风险基因。     

应用极速全基因组测序确诊Costello综合征1例

患儿 男,5小时龄,因“胎龄35 +2周早产、全身水肿5 h”于2021年6月入复旦大学附属儿科医院新生儿重症监护病房。患儿出生后表现为全身水肿、窒息,体重和头围均大于 P97,存在低血糖、呼吸衰竭、心功能不全、持续性肺动脉高压和隐睾等。住院期间患儿临床症状呈进行性加重,入院第4天应用极速家系全...     

基于快速和常规全外显子组分析技术对遗传性疾病的诊断程序比较

目的 探索可被临床医生直接应用的全外显子测序（WES）数据分析平台及方法。方法 选择复旦大学附属儿科医院（我院）临床诊断不明疾病的核心家系3例（例1~3）和仅先证者2例（例4和5）行WES分析,采用WuXi NextCODE临床测序数据分析系统（简称NextCODE平台）进行快速数据分析,并与我院分子诊断中心已建立的高通量数据分析流程（简称常规数据分析流程）进行参与人员及耗时的比较。结果 例1~3基于表型相关候选基因联合遗传模式的分析方法,分别检测到FGFR2基因杂合突变、GBE1基因复合杂合突变及TBX1基因杂合突变;例4和5通过表型相关候选基因分析,分别检测到IL10RA基因纯合突变和复合杂合突变。NextCODE平台自动完成3/7个步骤,从输入表型至生成报告,WES数据分析用时30 min以内。常规数据分析流程自动完成1/7个步骤,6个人工完成步骤需要多个专业人员进行数据的筛选及解读,从输入表型至生成报告,熟练的专业人员用时2~8 h。结论 5例临床诊断不明病例通过WES明确了诊断;NextCODE是直接为临床医生所用、简单快速的WES数据分析平台,有助于协助临床医生直接利用高通量测序数据,准确锁定致病突变,提高诊断效率。