乙型肝炎患者可溶性白细胞介素-2受体检测的临床意义

目的：探讨乙型肝炎患者血清中可溶性白细胞介素-2受体（sIL-2R）检测的临床意义。方法收集35例 HBeAg 阳性和26例 HBeAg 阴性的乙型肝炎患者（乙肝组）和18例健康对照者（健康对照组）血清标本,采用 ELISA 法检测 sIL-2R 水平,全自动生化分析仪检测丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平。结果乙肝组血浆 sIL-2R 水平[（370．2±140．5）pg/mL]高于健康对照组[（282．7±80．5）pg/mL],两者差异有统计学意义（P ＜0．05）。在乙肝组中,HBeAg 阳性者血清 sIL-2R 水平[（413．8±139．3） pg/mL]明显高于 HBeAg 阴性者[（311．5±121．3）pg/mL],两者差异有统计学意义（P ＜0．01）。61例乙型肝炎患者血清 sIL-2R水平与 ALT 水平呈正相关（r＝0．507,P ＜0．01）。结论乙型肝炎患者血清 sIL-2R 浓度增高,与 ALT 水平呈正相关,可用于监测乙型肝炎患者肝细胞损伤。     

HBV抗原肽-HLA-A*2402复合物四聚体的构建及初步检测应用

目的：构建2种HBV抗原肽-HLA-A＋2402复合物四聚体，并初步用该2种四聚体检测针对不同抗原肽特异性的细胞毒性T细胞（CTL）。方法：原核高效表达HLA-A＋2402-BSP和β2m蛋白后，分别与乙型肝炎病毒抗原肽P01756-764和Corell7-125在体外复性折叠成可溶性的HLA-A＋2402抗原肽复合物单体，经BirA酶作用并通过凝胶过滤层析法纯化复合物单体，分别将复合物单体与藻红蛋白标记的链霉亲和素按一定比例耦合构建成2种HBV抗原肽四聚体。最后进行流式细胞术检测。结果：Dot-ELISA和ELISA检测显示获得了2种具有天然构象的生物素化的HBV抗原肽-HLA-A＋2402复合物单体。结论：构建的2种四聚体可以检测乙型肝炎感染者体内特异性的CTL。     

三种常见HBV抗原肽-HLA-A*0201复合物四聚体的构建及初步检测应用

目的 体外构建三种常见HBV抗原肽-HLA-A*0201复合物四聚体,并初步用该三种四聚体对抗原肽特异性的细胞毒性T细胞(CTL)进行了初步检测.方法 原核高效表达的HLA-A*0201-BSP和β2m蛋白,分别和三种HBV抗原肽(HBVCore18-27,Env335-343,Po1575-583)体外复性折叠成可溶性的HLA-A*0201抗原肽复合物单体,经BirA酶作用并通过凝胶过滤层析法纯化复合物单体,分别将复合物单体与藻红蛋白标记的链霉亲和素按一定比例耦合构建成相应的三种抗原肽四聚体.最后进行流式细胞仪检测.结果 Dot-ELISA和ELISA检测显示获得了三种具有天然构象的生物素化的HBV抗原肽-HLA-A*0201复合物单体.构建的三种四聚体均可以检测到相应特异性的CTL,在自限性感染患者体内针对乙肝核心抗原(core18-27)的CTL细胞频数(0.18%)高于针对聚合酶抗原(po1575-583)(0.08%)和包膜抗原(env335-343)(0.06%).结论 成功构建了三种具有完整构象的生物素化HBV抗原肽-HLA-A*0201复合物单体,所构建的三种四聚体都可以检测到抗原特异性的CTL.     

抑癌基因DNA异常甲基化与宫颈癌研究进展

随着对宫颈癌发病机制的逐步深入研究,抑癌基因异常甲基化与宫颈癌的密切关系越来越受到重视。尽管甲基化标志物的开发还处于早期阶段,但它们已经显示出作为一种分子分类方法的强大前景。本文主要总结了宫颈癌的DNA甲基化研究进展,包括配对盒基因1(PAX1)、性别决定基因1(SOX1)、Ras相关区域家族1A基因(RASSF1A)和ZNFS82等,深入研究这些抑癌基因,可为宫颈癌的早期筛查、诊断及新治疗方案的探索提供良好的应用前景。     

中国旱獭β2m基因的克隆、原核表达及多克隆抗体的制备

目的 克隆、原核表达中国旱獭β2m基因,并制备多克隆抗体.方法 利用RT-PCR技术从中国旱獭脾细胞中扩增β2m基因,克隆至pET28a(+)质粒,构建原核表达载体pET-28a(+)-CWβ2m,再转化宿主菌Rosetta(DE3)pLacI诱导其表达.使用切胶回收纯化目的蛋白,将纯化蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,并采用酶联免疫吸附实验检测抗体的灵敏度和特异性.结果 克隆出的中国旱獭β2m基因,与GenBank已公布的土拨鼠的碱基序列一致;Western印迹结果显示克隆的β2m基因能在大肠埃希菌中高效表达,免疫家兔获得了高效价的多克隆抗体.结论 成功克隆了中国旱獭β2m基因,在原核宿主中进行了高效表达,获得的多克隆抗体具有较高的效价.为人工制备MHC-Ⅰ类分子复合物,深入研究嗜肝病毒感染过程中特异性CTL应答和效应机制奠定了基础.     

乙肝病毒蛋白抗原表位特异性CTL体外扩增条件优化

目的 优化乙肝蛋白抗原表位特异性CTL体外扩增条件.方法 选择急性自限性HBV感染者外周血,分离PBMC,体外用乙肝蛋白抗原表位多肽特异性刺激,特定天数后收集细胞,用CD8抗体与MHC-I类分子HBV抗原肽四聚体进行染色流式检测,检测扩增后乙肝蛋白抗原表位特异性CTL在CD8阳性细胞群中所占的频率.结果 1)在不同多肽浓度刺激下,当浓度在20 us/mL时,所测得特异性CTL占PBMC中CD8+T细胞的频率达到最高峰;2)固定刺激多肽浓度,在不同的刺激天数获得的特异性CTL频率第10天时最高;3)在不同的细胞因子培养条件中,当加入的细胞因子IL-2,IL-7,IL-15组合时所获得的特异性CTL频率最高.结论 在刺激肽浓度为20 μg/mL,并加入适量的细胞因子(IL-2,IL-7,IL-15),刺激10天的条件下,所获得的乙肝蛋白抗原特异性CTL频率最高.     

hVPS4A 基因克隆及真核表达载体的构建

目的：克隆人细胞空泡蛋白分选因子4A（human vacuolar protein sorting 4A,hVPS4A）基因,构建其真核表达质粒。方法以 Huh7细胞 cDNA 为模板,设计引物扩增全长 hVPS4A 基因,再将目的基因插入到真核载体 pRK5中。重组质粒经PCR、酶切和 DNA 测序确认。结果从 Huh7细胞 cDNA 中扩增得到约1350 bp 大小的目的片段,经回收、纯化、酶切后与载体pRK5连接,转化 DH5α大肠杆菌。选择 PCR 鉴定阳性的重组质粒,经 EcoRⅠ单酶切可见约一条5900 bp 片段;经 EcoRⅠ和HindⅢ双酶切可得到4600 bp 和1350 bp 两个片段,分别与载体 pRK5和目的片段 hVPS4A 预期大小一致;DNA 测序结果显示插入片段与 hVPS4A 参考序列一致。结论成功构建了含 hVPS4A 基因的真核表达载体,为进一步研究 hVPS4A 的生物学功能提供了条件。     

Frequencies and characterization of HBV-specific cytotoxic T lymphocytes in self-limited and chronic hepatitis B viral infection in China

Hepatitis B virus （HBV）-specific cytotoxic T lymphocytes （CTLs） are believed to play a major role in viral clearance and disease pathogenesis during HBV infection. To clarify the differences in host immune responses between self-limited and chronic HBV infections, we constructed three HLA-A＊0201/HBV tetramers with immunodominant epitopes of core18-27, polymerase 575-583 and envelope 335-343, and analyzed the HBV-specific CTLs in peripheral blood mononuclear cells （PBMCs） from patients infected with HBV. The frequencies and expansion ability of HBV-specific CD8＋T cells in most self-limited HBV infected individuals were higher than those in chronic HBV-infected patients. HBV-specific CD8＋T cells could be induced by in vitro peptide stimulation from chronic patients with a low level of serum HBV-DNA but not from those with a high level of serum HBV-DNA. In chronic infection, no significant correlation was found either between the frequencies of HBV-specific CD8^＋ T cells and the viral load, or between the frequencies and the levels of alanine transaminase. Our results suggested that the frequencies of HBV-specific CTLs are not the main determinant of immune-mediated protection in chronic HBV infection and immunotherapeutic approaches should be aimed at not only boosting a HBV-specific CD8^＋T response but also improving its function.     

Inhibition of HBV replication by VPS4B and its dominant negative mutant VPS4B-K180Q in vivo

This study examined the anti-hepatitis B virus (HBV) effect of wild-type (WT) vacuolar protein sorting 4B (VPS4B) and its dominant negative (DN) mutant VPS4B-K180Q in vivo in order to further explore the relationship between HBV and the host cellular factor VPS4. VPS4B gene was amplified from Huh7 cells by RT-PCR and cloned into the eukaryotic expression vector pXF3H. Then, the VPS4B plasmid and the VPS4B-K180Q mutation plasmid were constructed by using the overlap extension PCR site-directed mutagenesis technique. VPS4B and HBV vectors were co-delivered into mice by the hydrodynamic tail-vein injection to establish HBV vector-based models. Quantities of HBsAg and HBeAg in the mouse sera were determined by ElectroChemiLuminescence (ECL). HBV DNA in sera was measured by real-time quantitative PCR. Southern blot analysis was used to assay the intracellular HBV nuclear capsid-related DNA, real-time quantitative PCR to detect the HBV-related mRNA and immunohistochemical staining to observe the HBcAg expression in the mouse liver tissues. Our results showed that VPS4B and its mutant VPS4B-K180Q could decrease the levels of serum HBsAg, HBeAg and HBV-DNA. In addition, the HBV DNA replication and the mRNA level of HBV in the liver tissues of treated mice could be suppressed by VPS4B and VPS4B-K180Q. It was also found that VPS4B and VPS4B-K180Q had an ability to inhibit core antigen expression in the infected mouse liver. Furthermore, the anti-HBV effect of mutant VPS4B-K180Q was more potent than that of wild-type VPS4B. Taken together, it was concluded that VPS4B and its DN mutant VPS4B-K180Q have anti-HBV effect in vivo, which helps develop molecular therapeutic strategies for HBV infection.     

武汉地区女性人乳头瘤病毒疫苗相关型别感染率研究

目的:统计2017-2018年武汉地区女性人乳头瘤病毒(HPV)感染状况，并分析HPV疫苗相关型别(6、11、16、18、31、33、45、52、58)的年度变化及年龄分布特征。方法:选取2017-2018年在我院进行HPV分型检测的10 760例成年女性，采用流式荧光杂交法检测27型HPV感染情况。将受检者按18-30岁、31-44岁、45-54岁、55-64岁、≥65岁进行年龄分组；将HPV型别按是否为疫苗涵盖的九类亚型将其分为疫苗相关型别组和非疫苗相关型别组。统计分析不同年度、不同年龄层HPV检出率。结果:纳入的10 760例受检者中，27型HPV阳性检出率为19.80%。疫苗相关型别HPV阳性检出率为11.05%,其中高危型和低危型检出率分别为9.42%、3.41%。年龄分层分析显示，疫苗相关型别组HPV检出率随年龄增加而降低，其中18-30岁组检出率显著高于其它年龄组(P<0.05)。疫苗相关型别组中多重HPV亚型感染者共152例，混合感染率为1.41%,主要分布在低龄组。检出率较高的HPV亚型依次为：52、58、16、6型。结论:2017-2018年，武汉地区女性HP...