含内参基因的高灵敏度生殖支原体双重荧光PCR方法的建立

目的建立一种含有人源性内参基因的高灵敏度双重荧光PCR方法,以期用于生殖支原体感染的快速检测。方法根据生殖支原体MgPar重复序列中保守区域设计并合成特异性扩增引物和探针,添加人β-globin基因检测引物探针作为体系检测内参,建立并优化荧光PCR方法,使用标准浓度核酸进行扩增效率、灵敏度及特异度评价;用该方法检测62份临床标本,并与Mg-Pa荧光PCR结果相比较。结果建立的基于重复序列的荧光PCR方法对生殖支原体的检测限为0.5拷贝,Mg-Pa荧光PCR的检测限提高了一个数量级。该方法扩增16种其他支原体和常见生殖道致病菌均为阴性,特异度为100%。62份临床标本β-globin基因扩增均阳性,生殖支原体检测阳性率为3.2%(2/62)。结论建立的带内参检测生殖支原体的双重荧光PCR方法快速、灵敏、特异,并通过对标本进行质控,减少了假阴性结果的产生,提升了检测的准确性,具有良好的应用前景。     

咽拭子与支气管肺泡灌洗液荧光定量PCR检测儿童肺炎支原体感染分析

目的了解咽拭子标本以及支气管肺泡灌洗液(BALF)标本在肺炎支原体(MP)临床核酸检测、细菌定量以及实验室分离培养中的效果,初步评估咽拭子作为核酸检测及分离培养标本的意义,并评估MP肺炎患儿的同期咽拭子的MP核酸载量能否准确预测出BALF的MP核酸载量。方法采集29例MP肺炎住院患儿的同期咽拭子及BALF,利用人源性β-globin内参基因质控所有标本采集及核酸提取质量,合格标本使用MP荧光定量PCR对同一患儿同期咽拭子及BALF标本中MP进行定量分析,计算两种标本的MP核酸载量。并对所有标本进行MP培养,比较两类标本的MP阳性培养率、细菌污染率。结果标本的β-globin内参基因检测阳性率为100%,咽拭子和BALF标本荧光PCR检测阳性率均为86.2%(25/29),其中咽拭子MP核酸定量范围是3.2×10~2拷贝/ml～1.8×10~7拷贝/ml,BALF为6.8×10~2拷贝/ml～5.4×10~8拷贝/ml。两种方法检测结果一致率为93.1%(27/29)。按照BALF标本MP载量递增排序后,阳性标本的咽拭子载量没有显示出类似的伴随升高趋势。BALF标本培养阳性率为65.5%(19/29),标本污染率为6.9%(2/29);咽拭子标本的MP培养阳性率为51.7%(15/29),标本污染率为51.7%(15/29)。结论咽拭子可以作为MP荧光PCR定性检测标本使用,但其不适合用于MP的定量研究,这说明咽拭子的MP核酸载量与BALF中载量不存在明显的相关性;BALF相比咽拭子标本培养率高、污染率低,更适合MP分离培养研究。     

多种一步法快速提取DNA对肺炎支原体PCR检测的影响

目的 对比不同一步法提取DNA在肺炎支原体PCR检测中的效果及应用范围,为临床标本中肺炎支原体的检测提供依据。方法 以两种经典的DNA提取一步法（ROSE和Chelex-100法）及其优化方案和商品化DNA提取试剂盒,提取肺炎支原体纯培养菌株及30份肺炎支原体阳性临床咽拭子标本DNA,分别进行普通PCR和荧光PCR检测,对比不同方法提取的DNA对PCR检测结果的影响。结果 ROSE法和Chelex-100一步法中的SDS严重影响Taq酶活性,提取物稀释100倍方可进行荧光PCR扩增,稀释10倍可用于普通PCR扩增。改良的Chelex-100一步法提取肺炎支原体纯菌DNA产量最高,且PCR扩增效果最好。对于30份临床标本来说,试剂盒法、改良Chelex-100法和水煮法的阳性率分别为100.00%（30/30）、80.00%（24/30）和43.33%（13/30）,且对相同肺炎支原体阳性标本提取的DNA,试剂盒法检测的循环阈值（Ct值）比上述两种方法分别小1.95和2.38。结论 经典一步法提取的DNA必须经稀释后方可作为扩增模板。改良的Chelex-100法操作简便,可用于纯菌培养的DNA提取。临床标本中肺炎支原体DNA提取以试剂盒法最优,改良的Chelex-100法提取的DNA也可用于临床标本中肺炎支原体的检测,但不可用于定量分析。     

基于颜色判定的环介导等温扩增检测人型支原体的研究

目的建立一种基于颜色判定的快速、灵敏、简便的人型支原体环介导等温扩增(LAMP)方法。方法使用PrimerExplorer V5软件设计针对人型支原体MHO_2540基因保守区域的4条特异等温扩增引物,用羟基萘酚蓝(HNB)作为结果判读指示剂并优化体系中dNTPs、MgSO_4浓度,建立人型支原体LAMP检测方法,进行灵敏度、特异度等的检测并与普通PCR比较。结果LAMP对标准浓度人型支原体核酸的检测限约为10~(2 )CFU,与普通PCR相同,但比实时荧光定量PCR差一个数量级。人型支原体阳性临床标本拷贝数10~(3 )CFU者LAMP阳性率100%,与普通PCR检出率(100%)一致,拷贝数10~1~10~(3 )CFU的弱阳性标本LAMP检出率为63.6%(14/22),普通PCR检出率为31.8%(7/22),差异有统计学意义(χ~2=4.46,P0.05)。结论LAMP检测人型支原体敏感、特异且操作简便,可在基层推广应用。     

肺炎支原体热休克蛋白HSP70的表达、纯化及其免疫原性分析北大核心CSCD

目的构建肺炎支原体(MP)热休克蛋白HSP70重组原核表达质粒,纯化并鉴定其免疫原性。方法以肺炎支原体ATCC 29342为模板,利用搭桥PCR扩增HSP70全序列,胶回收纯化后测序验证。使用BamH1和Xho1双酶切PCR产物,构建重组表达质粒pGEX-4T-1-HSP70,转入大肠埃希菌BL21中,经IPTG诱导目的蛋白表达,对表达产物进行12.5%SDS-PAGE和质谱鉴定。利用AKTA explore 100蛋白纯化仪纯化重组HSP70,以此为抗原与MP感染者血清进行Western blot,检测其免疫反应性。结果搭桥PCR成功完成HSP70基因A1728G突变,重组质粒pGEX-4T-1-HSP70构建正确,转化BL21后经IPTG诱导表达分子质量单位92 ku含GST标签的重组HSP70,纯化蛋白经Western blot检测能与感染Ⅰ型和Ⅱ型MP菌株患儿血清发生特异性反应。结论获得重组HSP70完整蛋白,纯化产物具有免疫反应性,为制备高效防治肺炎支原体感染的基因工程疫苗及研究HSP70蛋白的免疫学功能奠定了基础。     

TaqMan-MGB探针实时荧光定量-聚合酶链反应检测肺炎支原体方法的建立

目的 建立敏感、特异的TaqMan-MGB探针实时荧光定量-聚合酶链反应(real-time PCR)快速检测方法,为临床标本中肺炎支原体快速检测提供技术支持。方法 选取肺炎支原体重复序列RepMP23中保守区域设计、合成特异性扩增引物和TaqMan-MGB探针,建立并优化real-time PCR检测方法。对优化后的方法使用标准浓度核酸进行扩增效率、灵敏度及特异度评价,并与已报道的肺炎支原体荧光PCR方法进行比较。结果 本研究建立的TaqMan-MGB探针荧光PCR方法对肺炎支原体的检测限为0.2 cfu,比普通TaqMan real-time PCR检测限(3～5 cfu)提高了一个数量级。其检测标准曲线的循环阈值(Ct) 与模板拷贝数呈良好的线性关系(R2=0.999)。用该方法扩增23种呼吸道常见病原菌染色体及人类染色体,结果均为阴性,特异度为100%。结论 TaqMan-MGB探针real-time PCR方法可快速、灵敏、特异地检测肺炎支原体,有很好的应用前景与价值。     

健康体检儿童肺炎支原体检出情况研究

目的了解参与健康体检儿童人群的肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae, Mp)检出情况。方法随机入组2023年参与健康体检的6～12岁小学生1 303人, 采集受试者口咽拭子及静脉血标本, 使用分离培养、核酸检测以及血清学抗体方法检测受试者Mp检出情况, 并进行统计学分析。结果 1 303例健康儿童中Mp培养阳性检出率为4.1%(53/1 303), 核酸阳性检出率为7.3%(95/1 303), 血清学IgM抗体阳性检出率为13.6%(177/1 303)。经统计学分析, 健康儿童人群中Mp培养与核酸检测以及血清IgM抗体检测阳性率之间的差别均具有统计学意义(P<0.05)。结论 2023年健康体检儿童中Mp检出率约为4.1%。分离培养方法对健康人群中Mp检出率检测准确性优于核酸以及血清学方法, 核酸和血清学方法会高估正常人群中Mp检出率。