表达PD-1 shRNA增强靶向CD19 CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力

目的：设计和构建表达PD-1 shRNA的靶向CD19 CAR-T细胞并验证其体外肿瘤细胞杀伤能力。方法：设计并构建 表达PD-1 shRNA的CD19 CAR分子基因,将其包装成逆转录病毒载体,通过qPCR法检测病毒载体拷贝数。将慢病毒转导人原 代T细胞,获得三种CAR-T细胞,分别为RNAU6-CD19 CAR-T、PD-1 shRNA1-CD19 CAR-T、PD-1 shRNA2-CD19 CAR-T细胞。 采用qPCR法检测三种CAR-T细胞中PD-1 mRNA的表达水平,流式细胞术检测三种CAR-T细胞中PD-1表达水平,萤光素酶报 告基因实验、流式细胞术检测在不同效靶比时 CAR-T 细胞对 CD19 阳性靶细胞（人淋巴瘤 daudi 细胞）的杀伤功能。结果： RNAU6-CD19 CAR、PD-1 shRNA1-CD19 CAR、PD-1 shRNA2-CD19 CAR 三种 CAR 分子成功包装成逆转录病毒载体,病毒载 体拷贝数均高于 1×107 拷贝/mL,转导人原代 T 细胞获得 CAR-T 细胞,RNAU6-CD19 CAR-T、PD-1 shRNA1-CD19 CAR-T、PD-1 shRNA2-CD19 CAR-T细胞转导效率分别为43.1%、55.1%、41.7%。与RNAU6-CD19 CAR-T细胞相比,PD-1 shRNA1-CD19 CAR-T、 PD-1 shRNA2-CD19 CAR-T细胞中PD-1 mRNA表达水平均显著降低（均P<0.01）、细胞表面PD-1表达水平更低（均P<0.01）、体 外对daudi细胞的杀伤率更高（P<0.05或P<0.01）。结论：成功构建表达PD-1 shRNA的靶向CD19 CAR-T细胞,其对CD19阳性 靶细胞的杀伤率显著提高,PD-1 mRNA及其翻译产物PD-1的表达减少,CAR-T细胞的耗竭减缓。     

干扰TOX基因联合抗CD38CAR-T细胞的构建及其对血液肿瘤细胞增殖和凋亡能力的影响

目的 构建干扰胸腺细胞选择相关高迁移率群体盒(TOX)基因联合抗CD38 CAR-T细胞,观察其对血液肿瘤细胞增殖和凋亡能力的影响.方法 采集健康志愿者外周血,分离单个核细胞(PBMC),提取原代T淋巴细胞.构建以shRNA技术靶向抑制TOX的抗CD38 CAR分子,分别命名为TOX-shRNA1-CD38 CAR和T...     

应用CRISPR/Cas9技术构建Raji-Luc CD19 KO淋巴瘤细胞系

目的 应用CRISPR/cas9技术构建敲除CD19的Raji-Luc淋巴瘤细胞,并对其免疫逃逸能力进行初步验证。方法构建PB-CRISPR-CD19小向导RNA(small guide RNA, sgRNA)质粒,筛选最优的sgRNA序列,用pCAG-PBase转座酶、PB-CD19 sgRNA及PB-CRISPR-Cas9共同电转染Raji-Luc细胞,采用流式分选和极限稀释法筛选得到稳定敲除的单克隆细胞株。经过基因序列检测对敲除效果进行验证;酶标仪检测细胞系表面荧光素酶的表达情况;以实验室前期构建的CD19 CAR-T和CD38 CAR-T作为效应细胞,用荧光素酶化学发光法验证Raji-Luc CD19 KO细胞株的免疫逃逸能力。结果 电转染制备的Raji-Luc CD19 KO细胞转染效率较高,筛选所得两组单克隆细胞敲除效率均达到99%以上,与原始Raji-Luc细胞的荧光素酶表达无显著差异,且不能激活CD19 CAR-T细胞对其进行杀伤。结论 成功构建了Raji-Luc CD19 KO淋巴瘤细胞系。     

shRNA靶向抑制CD38的抗CD38 CAR-T细胞构建及其功能的初步鉴定

目的：探讨shRNA靶向抑制CD38的方法能否增强抗CD38 CAR-T细胞的抗癌功能。方法：构建shRNA靶向抑制CD38的抗CD38 CAR-T细胞的CAR分子,利用逆转录病毒载体包装成功后转导人原代T细胞,制备CAR-T细胞。实验分为shRNA1 CD38 CAR-T组、shRNA2 CD38 CAR-T组和对照组（shR-NC-CD38 CAR-T细胞）。采用qPCR法检测CAR-T细胞CD38 mRNA相对表达水平,计算CAR-T细胞培养0～14 d的增殖倍数,CFSE法检测CAR-T细胞与人Burkitt淋巴瘤细胞Raji-luc或人多发性骨髓瘤外周血B淋巴细胞RPMI-8226-luc共培养时的增殖情况,荧光素酶化学发光法检测CAR-T细胞在不同效靶比（1∶1、1∶2、1∶4、1∶8）时对Raji-luc和RPMI-8226-luc细胞的杀伤效率,ELISA法检测CAR-T细胞杀伤Raji-luc或RPMI-8226-luc细胞时上清液中IFN-γ水平,FCM检测CAR-T细胞表面耗竭T细胞生物标志物PD-1的表达水平。结果：shR-NC-CD38 CAR、shRNA1-...     

女性围绝经期性激素水平与性欲障碍的关系和雌激素替代疗法干预的作用及意义

目的 探究女性围绝经期性激素水平与性欲障碍的关系,并分析雌激素替代疗法干预的作用与意义。方法 选取2018年3月至2021年3月海南现代妇女儿童医院就诊的103例围绝经期女性作为研究对象,根据女性性功能指数(FSFI)问卷调查结果分为性欲正常组(n=22)与性欲障碍组(n=81)。比较两组性欲评分、绝经指数、性激素[雌二醇(E₂)、卵泡生成素(FSH)、孕酮(P)、睾酮(T)]水平,分析性激素水平与性欲评分、绝经指数的相关性及对性欲障碍的预测价值;性欲障碍组均给予雌激素替代疗法干预,对比不同干预效果患者性激素变化。结果 性欲障碍组性欲评分、E₂、P、T水平低于性欲正常组,绝经指数、FSH高于性欲正常组(P<0.05);E₂、P、T水平与性欲评分呈正相关,与绝经指数呈负相关,FSH与性欲评分呈负相关,与绝经指数呈正相关(P<0.05);受试者工作特征(ROC)曲线显示,E₂、P、T、FSH联合预测性欲障碍的曲线下面积(AUC)为0.920,高于各指标单独预测。性欲障碍组经雌激素替代疗法干预...