肝癌细胞特异性结合双价抗体的构建表达与鉴定

目的 构建和表达与肝癌细胞特异结合的双价单链抗体（bivalent single-chain Fv，BsFv），并鉴定该双价抗体的生物活性。方法 以与肝癌细胞特异结合的单链抗体（scFv）为模板，设计引物引入中间连接肽（G4s）及酶切位点AscI，通过聚合酶链反应（PCR）方法扩增出两个scFv片段，将其连入原核表达载体pAB1；构建的表达载体转化大肠埃希菌TG1，挑取单克隆细菌进行扩增，提取质粒酶切、测序鉴定。阳性菌经IPTG诱导表达，表达产物经SDS-PAGE，Western blot鉴定，间接免疫荧光流式细胞术（FACS）测定与肝癌细胞特异结合的特性。结果 经酶切鉴定以及DNA测序结果表明该BsFv构建成功，SDS．PAGE、Western blot鉴定表明表达蛋白相对分子量与BsFv理论值一致，且表达产物同亲本scFv比较，与肝癌细胞特异结合活性增强。结论 BsFv构建成功，BsFv较scFv具有明显优势，为其用于临床肿瘤的诊断和治疗奠定了基础。     

表达增强型绿色荧光蛋白K562细胞株的建立及其检测自然杀伤细胞活性的效果评价

目的建立一种准确、稳定的自然杀伤细胞(NK)活性检测方法。方法通过电穿孔法将含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的质粒转入K562细胞,经G418筛选后进行克隆,获得EGFP阳性表达细胞株;采用流式细胞仪和乳酸脱氢酶法检测10名健康人外周血NK细胞活性。结果通过基因转染的方法得到1株稳定表达EGFP的K562细胞,转染EGFP对细胞生长无影响,10名健康人外周血NK细胞对转染EGFP的细胞及未转染细胞的杀伤活性无差异(P>0.05);表达EGFP的K562细胞在效靶比为40∶1时,用流式细胞仪检测培养2和4h时的NK细胞杀伤率分别为(21.5±1.3)%和(23.7±1.5)%,二者无差异(P>0.05);而用乳酸脱氢酶法测定培养4h的NK细胞对K562和EGFP-K562的杀伤率[分别为(23.6±2.3)%和(23.7±2.3)%]均高于2h的杀伤率[(18.0±1.1)%和(18.2±1.3)%,P<0.05]。结论成功建立了表达EGFP的K562细胞株,将该细胞株作为靶细胞用于流式细胞术检测NK细胞活性时,无需预先染色和标记靶细胞,且操作简便、省时、稳定、可靠。     

抗TfR单链抗体-AP融合蛋白的构建、表达与鉴定

目的构建、表达和鉴定抗转铁蛋白受体(TfR)单链抗体———碱性磷酸酶(AP)融合蛋白。方法用SfiⅠ和NotⅠ分别酶切抗转铁蛋白受体scFv表达质粒pUC19/119,获得scFv基因,直接亚克隆到表达载体pDAP2中,在TG1菌中表达scFvAP融合蛋白,SDSPAGE分析scFvAP的分子量,酶免疫测定鉴定其抗体和酶活性。结果scFvAP融合蛋白表达载体经scFv特异性引物PCR扩增,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳可见约700bp条带,符合scFv基因理论值大小,IPTG诱导产物经SDSPAGE分析可见约为75ku的蛋白条带,符合scFvAP融合蛋白分子量的理论值大小,直接细胞ELISA测定证明表达产物scFvAP融合蛋白具有结合人TfR和AP活性的双重功效。结论抗人scFvAP融合蛋白表达载体构建成功,表达产物具有结合人TfR和AP活性的双重功效,为其临床检测应用奠定了基础。     

TRAIL对肿瘤侵润CD4~+CD25~+Treg的调节作用

目的:探讨TRAIL对肿瘤侵润CD4+CD25+Treg细胞的调节作用。方法:ELISA检测TRAIL对肿瘤细胞分泌CCL22的影响;建立对TRAIL耐受的4T1肿瘤细胞皮下实体瘤模型,瘤内给予重组TRAIL蛋白,检测肿瘤体积的变化;分离肿瘤侵润的淋巴细胞,采用流式细胞术检测瘤内CD4+CD25+Treg细胞的变化。结果:TRAIL引起肿瘤细胞4T1和B16培养上清中CCL22水平增加;TRAIL治疗组与对照组相比,对TRAIL耐受的4T1移植瘤体积没有明显变化,但TRAIL治疗组的肿瘤侵润CD4+CD25+Treg细胞显著增加。结论:TRAIL引起肿瘤细胞分泌CCL22,可因此诱导CD4+CD25+Treg细胞趋化至肿瘤部位导致肿瘤侵润的CD4+CD25+Treg比例增加,为TRAIL的生理功能和在肿瘤治疗中的应用提供了新的资料。     

TRAIL对CIA小鼠脾细胞表达Th1/Th2细胞因子的影响

 摘要：目的 观察肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（Tumor Necrosis Factor Related Apoptosis Inducing Ligand , TRAIL）对胶原诱导型关节炎（Collagen-induced arthritis, CIA）小鼠的治疗效果,探讨TRAIL治疗类风湿性关节炎（Rheumatoid Arthritis, RA）的可能机制。方法 牛Ⅱ型胶原蛋白加弗氏完全佐剂免疫DBA/1J小鼠建立CIA模型,采用重组腺相关病毒AAV-TRAIL关节腔内注射进行治疗。CBA和流式细胞术检测Th1/Th2细胞因子的分泌。结果 AAV-TRAIL可改善CIA小鼠的病情,体外研究其机制发现TRAIL可抑制CIA小鼠的脾细胞分泌Th1型细胞因子,但对Th2型细胞因子没有作用。结论TRAIL对CIA小鼠的治疗作用可能和TRAIL抑制Th1型细胞因子分泌相关。