乙型肝炎病毒多聚酶末端蛋白重链可变区抗体体外抑制病毒的复制

目的用蛋白片段互补法(PCA)选择HBV多聚酶末端蛋白(TP)重链可变区(VH)抗体,研究特异性VH抗体体外抑制HBV的复制与分泌。方法以HBV多聚酶TP区为抗原,用PCA法进行特异性VH抗体筛选。特异性VH抗体基因定向亚克隆人真核表达载体pZeoSV2( ),构建pZeoSV2( )-VH重组质粒,用脂质体介导的转染技术,将其导入HepG 2.2.15细胞,观察特异性抗体的生物学活性。结果用PCA法从抗体库中选择出3个特异性抗体:VH1、VH2和VH3,其中与抗原亲和力最高的是VH1。转染pZeoSV2( )-VH1的HepG 2.2.15细胞比未转染pZeoSV2 ( )-VH1或只转染空载体pZeoSV2( )的HepG 2.2.15细胞病毒颗粒分泌明显减少,上清液内为2.978 7±0.276 1比5.150 4±0.276 1和5.295 1±0.241 0(P<0.05);细胞内为5.283 9±0.162 9比8.300 4±0.323 2和8.532 1±0.138 3(P<0.05)。结论用PCA法可从抗体库中选择出HBV多聚酶TP区特异性VH抗体,该抗体在体外可抑制HBV的复制与分泌。     

蛋白转导结构域介导乙型肝炎病毒聚合酶末端蛋白重链可变区抗体体外抑制病毒的复制

目的 蛋白转导结构域(TAT)介导HBV聚合酶末端蛋白(TP)重链可变区(VH)抗体,研究特异性TAT-VH抗体体外对HBV复制的影响.方法 将TAT-VH基因克隆入原核表达载体pET28a(+),在大肠埃希菌BL21(DE3)LysS内诱导融合蛋白表达并进行纯化.纯化的TAT-VH加入培养的HepG2.2.15细胞,间接免疫荧光法检测其导入HepG2.2.15细胞的效率,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测其对细胞生长代谢的影响,将TAT-VH加入培养的HepG2.2.15细胞,定量PCR法检测HBV DNA水平.数据行单因素方差分析和t检验.结果 成功制备了TAT-VH融合蛋白,间接免疫荧光及MTT证实TAT-VH可以跨膜导入HepG2.2.15细胞,且对细胞生长无影响;加入5 000 nmol/L TAT-VH的HepG2.2.15细胞培养上清液内HBV DNA为(1.211±0.132)lg拷贝/mL,对照组为(5.325±0.041)lg拷贝/mL(t=72.91,P＜0.05);细胞内分别为(3.521±0.411)和(8.532±0.132)Ig拷贝/mL(t=28.41,P＜0.05).结论 HBV聚合酶TP区特异性TAT-VH抗体在体外可抑制HBV复制,为应用细胞内抗体治疗HBV感染提供了良好的实验基础.     

螺旋CT在齿状突骨折漏误诊的价值

目的分析螺旋CT扫描在诊断齿状突骨折中的价值。方法回顾性分析螺旋CT病在误诊12例齿显示骨折的横断面骨窗,软组织窗及冠状面、矢状面重建。结果根据骨折部位将齿状突骨折分为三型:Ⅰ型1例,Ⅱ型8例,Ⅲ型3例。结论螺旋CT扫描对齿状突骨折的确诊,避免漏误诊,确定手术方案具有重要价值。     

标准大骨瓣减压意义

目的探讨标准大骨瓣在重型颅脑损伤救治中的减压意义,加深临床对标准大骨瓣减压作用的理解。方法结合我院2000年1月-2007年1月46例重型颅脑损伤的患者资料进行回顾性分析。结果本组46例患者均行标准大骨瓣减压,术中全部放置颅内压监测探头,术后持续颅内压监测1周,联用人血清蛋白或血浆、甘露醇、速尿脱水,颅内压一般在15-30 mmHg范围内。术后3d、1周、2周、1个月复查CT。2例发生右额叶脑梗死,1例发生右顶枕叶脑梗死。术后随访6个月至1年,效果良好26例,中残8例,重残6例,植物生存4例,死亡2例。结论标准大骨瓣入路可多途径的达到减压作用,在重型颅脑损仍的救治中有着重要的内、外减压意义。     

应用单链构象多态性和异源双链分析研究拉米夫定耐药变异

目的 应用单链构象多态性/异源双链分析技术研究慢性乙型肝炎患者拉米夫定治疗前后乙肝病毒准种组成的改变。方法 聚合酶链反应扩增6例患者治疗前后共12份血清标本中目的片段并逐一分析。结果 拉米夫定治疗前患者体内乙肝病毒聚合酶基因序列准种组成较复杂,准种数在7-14(平均9.8),均高于治疗后准种数4-8(平均5.7),t=3.98,P<0.05。6例患者治疗前的准种分布中有一种或两种优势准种,但比例较低(33.3％-81.80％);治疗后显著升高(78.80％-90.9％),t=3.24,P<0.05。选择优势克隆测序,6例患者经拉米夫定治疗后2例在酪氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸(YMDD)序列出现M550V/L528M,3例为M5501变异,1例无变异。结论 采用单链构象多态性/异源双链分析技术对人体内病毒作整体性的研究,可避免其他研究方法的片面性,为发现新的变异点提供机会,进一步解释拉米夫定的耐药机制。     

蛋白转导结构域介导乙型肝炎病毒聚合酶末端蛋白重链可变区抗体体外抑制病毒的复制

Objective To study a functional variable fragment of heavy chain(VH)antibody against the terminal protein(TP)region of hepatitis B virus(HBV)polymerase introduced by human immunodeficiency virus Tat protein transduction domain(TAT)and the inhibitive activity of TAT-VH on the replication of HBV in vitro.Methods The gene encoding TAT-VH was cloned into prokaryotic expression vector pET28a(+).Recombinant plasmid was transduced into E coli BL21(DE3)LysS,then the protein was expressed and purified.The purified TAT-VH fusion protein was added into HepG2.2.15 cell culture.The transduction efficiency was evaluated by indirect fluorescence assay(IFA).The cytotoxicity of TAT-VH was detected by Methabenzthiazuron(MTT)assay.HBV DNA level in HepG2.2.15 cell culture was measured using quantitative polymerase chain reaction(PCR).The data were analyzed by one-factor analysis of variance and t test.Results TAT-VH fusion protein was successfully expressed and purified.It was confirmed by IFA and MTT assay that TAT-VH was introduced into HepG2.2.15 cells and the cell growth was not affected.The level of HBV DNA in supernatant of HeDG2.2.15 cell culture with 5 000 nmol/L TAT-VH was(1.211±0.132)lg copy/mL,which was significantly lower than control group[(5.325±0.041)lg copy/mL,t=72.91,P＜0.05].Meanwhile,the level of intracellular HBV DNA was(3.521±0.411)lg copy/mL,which was significantly lower than control group[(8.532±0.132)lg copy/mL.t=28.41,P＜0.05].Conclusion The HBV replication is inhibited by anti-TP TAT-VH antibodies in vitro,which provides valuable experimemal basis for developing therapy of HBV infection with intracellular antibody.     

严重急性呼吸综合征患者肺组织中S基因病毒准种特性的初步研究

严重急性呼吸综合征(SARS)病原体是一种与冠状病毒(coronaviruses)类似的新的正链 RNA 病毒,基因组全长约为30 kb,包括复制酶 A、复制酶 B、S、E、M 基因编码区和14个目前尚未清楚功能的开放阅读框。SARS 病毒的变异率估计为每天(8.26×10~(-6)±2.16×10~(-6))/nt,与普通RNA 病毒类似。SARS 病毒感染呈很短暂的急性自限性过程,变异株在患者体内能否积累形成准种,所形成准种的异质性如何?有关研究目前报道还不多,为此我们采用构象敏感凝胶电泳(CSGE)及核酸序列分析的方法初步检测了1例患者肺组织中 SARS 病毒准种的复杂性及差异性,结果报道如下。     

α—地中海贫血早期产前诊断

目的：探索α－地中海贫血早期产前诊断的方法：方法：利用聚合酶链反应技术对８例高危妊娠者采用绒毛取样进行缺失型α－地中海贫血的早期产前诊断；结果：检测出胎儿水肿综合征２例，杂合子４例，正常胚胎２例，其中３例 期行羊水检查，证实了绒毛诊断的准确性，结论；绒毛取样是诊断缺失型α－地中海的一种安全可行的孕早期产前诊断方法。