晚期糖基化终产物对单核细胞产生炎性细胞因子作用的剂量与时间依赖性

目的:观察晚期糖基化终产物对单核细胞产生白细胞介素6、白细胞介素1β和肿瘤坏死因子α的刺激作用.方法:实验于2007-02/06在长治医学院中心实验室完成.[1]血脂正常的健康成人外周血(由长治医学院附属和平医院血库提供);正常人AB血清(中国科学院上海细胞研究所,批号TBD0081HAB);内毒素和正常人血清白蛋(Sigma公司).[2]采用Lymphoprep密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞,置于含体积分数0.1的人AB血清、2mmol/L的L-谷氨酰胺、25mmol/L Hepes的RPMI-1640中培养,选择性贴壁法纯化细胞.鼠抗人CD68 IgG1和羊抗鼠IgG1-Texas Red免疫荧光染色,阳性者为单核细胞.调整细胞浓度为1×109L-1备用.[3]将3.55g/L人血清白蛋白与200mmol/L葡萄糖在400mmol/L磷酸盐缓冲液中37℃孵育56d.pH7.4磷酸盐缓冲液透析,以除去未结合的葡萄糖.以Detoxi-Gel column去除晚期糖基化终产物修饰蛋白中可能污染的内毒素,即为晚期糖基化终产物修饰的人血清白蛋白.[4]将1×109L-1单核细胞接种于24孔板,1.0mL/孔.RPMI-1640中分别加入12.5,25,50,100,200mg/L晚期糖基化终产物修饰的人血清白蛋白,与单核细胞共同孵育12,24,48和72h.以同等剂量未加修饰的人血清白蛋白和单纯RPMI-1640作为阴性对照.酶联免疫吸附法检测单核细胞上清中白细胞介素6、白细胞介素1β和肿瘤坏死因子α表达水平.结果:[1]与RPMI-1640阴性对照组、单纯人血清白蛋白100mg/L阴性对照组比较,孵育48h时100mg/L晚期糖基化终产物修饰的人血清白蛋白诱导单核细胞产生白细胞介素6达到最大剂量和时间效应(F=2.68~2.93, P均=0.00).[2]与RPMI-1640阴性对照组、单纯人血清白蛋白100mg/L阴性对照组比较,孵育24h时50mg/L晚期糖基化终产物修饰的人血清白蛋白诱导单核细胞产生白细胞介素1α达到最大剂量和时间效应(F=1.22~1.30, P均=0.00).[3]晚期糖基化终产物修饰的人血清白蛋白诱导单核细胞产生肿瘤坏死因子α情况与产生白细胞介素1β相似.结论:晚期糖基化终产物修饰的人血清白蛋白以剂量和时间依赖的方式刺激单核细胞合成白细胞介素6、白细胞介素1β和肿瘤坏死因子α.     

不同培养条件对人胚胎肝细胞形态和表型的影响

目的:探讨适宜的人胚胎肝细胞培养条件.方法:采用胶原酶两步灌流法分离20-24 wk人胚胎肝细胞,非连续性Percoll密度梯度离心法纯化细胞,用Ham's F12普通培养基和条件培养基培养胚胎肝细胞.观察培养细胞的形态特征,免疫荧光法检测胚胎肝细胞角蛋白×18(Cytokeratin 18,CK18)和甲胎蛋(alpha-1-fetoprotein,AFP)表达,MTT法检测细胞活力和增殖能力.结果:在条件培养基培养不同时间的胚胎肝细胞始终呈现特异性多角形形态,100%表达CK18和AFP,细胞增殖活跃.活力无明显下降.而在普通培养基培养24 h时,部分细胞即呈现成纤维细胞梭样形态,仅56%细胞表达CK18,43%细胞表达AFP,在培养72 h细胞均呈现成纤维细胞梭样形态,细胞增殖及活力下降(0.25±0.03 vs 1.01±0.12,P<0.001),至培养第7天细胞CK18及AFP表达呈阴性,细胞增殖及活力显著下降(0.17±0.04 vs 0.94±0.12,P<0.001).结论:Ham's F12条件培养基体外能够显著促进人胚胎肝细胞增殖,维持胚胎肝细胞的特异性形态和表型的稳定.