抗血小板膜糖蛋白Ibα胞内段多肽多克隆抗体的制备及初步应用

目的 制备兔抗人血小板膜糖蛋白(GP)Ibα C端557～561氨基酸序列多肽的多克隆抗体,并初步用于人血小板GPIbα C端559位丝氨酸磷酸化状态的检测.方法 应用化学方法合成C-R-G-S-L-P(559位丝氨酸非磷酸化,Ser559)和C-R-G-s(p)-L-P(559位丝氨酸磷酸化,pSer559)多肽.将2种多肽分别与钥孔蜮血蓝蛋白交联后,以皮下注射法分别免疫新西兰大白兔,分离获得2种抗血清(抗Ser559多抗和抗pSer559多抗).应用斑点印迹和酶联免疫吸附试验(ELISA)方法 对抗血清进行鉴定并检测效价.从人血小板裂解液中分离纯化血小板GPIbα,利用抗Ser559多抗和抗pSer559多抗、采用ELISA方法检测人血小板GPIbαC端559位丝氨酸磷酸化状况.结果 所制备的2种多抗分别特异性识别各自抗原,效价分别为1:32 000和1:64 000.2种多抗均可与纯化的人血小板GPIbα特异结合,表明人血小板GPIbα 559位点丝氨酸存在磷酸化与非磷酸化两种状态.结论 应用人工合成多肽成功制备出2种可特异性识别丝氨酸磷酸化状态的兔抗人血小板GPIbα胞内段多肽多抗,并证明人血小板GPIbαC端559位丝氨酸存在磷酸化状态.     

血小板膜糖蛋白(GP)Ⅰbα胞内区551到565氨基酸序列对GPⅠbα结合VWF功能的调控作用

目的 探讨血小板膜糖蛋白(GP)Ⅰ bα胞内区551到565氨基酸序列对GPⅠ bα结合血管性血友病因子(VWF)功能的调控作用。方法 以同时表达野生型GPⅠ bα、GP Ⅰ bβ和GPⅨ三种蛋白的中国仓鼠卵巢细胞株(1b9)、同时表达野生型GP Ⅰ bβ、GPⅨ和在565或551以后氨基酸序列缺失的GPⅠ bα的中国仓鼠卵巢细胞株(△565或△551)为模型,采用流式细胞术检测细胞株的GP Ⅰbα在瑞斯托霉素诱导下结合VWF的能力,流动腔技术检测细胞株在流体剪切力条件下(200 s-1)在VWF表面的黏附状况,激光共聚焦技术检测细胞株在botrocetin诱导下在VWF表面的铺展状况。结果 与对照1b9和△551相比,△565细胞株在ristocetin诱导下其GPⅠ bα结合VWF的能力最强(P＜0.01),在VWF表面黏附的△565细胞数量最多(P＜0.05),在botrocetin诱导下△565细胞株在VWF表面的铺展面积最大(P＜0.05)。结论 GP Ⅰ bα胞内区551到565氨基酸序列对GP Ⅰ bα结合VWF的功能具有重要调控作用。     

体外血小板流动腔研究方法的建立和应用

目的建立模拟体内血液流动环境下，实时观察、研究血小板与血管表面血管性假性血友病因子（vWF）相互作用的模型。方法利用包被vWF的细玻璃管模拟血管，分别采用负压装置、蠕动泵和恒流注射泵产生不同流态和精确剪切率的流体环境，结合倒置显微镜和电荷耦合器件图像传感器（CCD，Charge—coupled device）实时观察和记录血小板或细胞在流体作用下的一系列反应。结果血小板和转染了血小板糖蛋白Ⅰb-Ⅸ的中国仓鼠卵巢细胞（Chinese hamster ovary，CHO），在不同流态下都可与玻璃管壁上的vWF相互作用，从而介导血小板或CHO细胞与玻璃管壁的瞬时结合（滚动），并最终牢固结合在玻璃管壁上。结论本研究方法可以在精确剪切率和不同流态的流体环境条件下，实时地观察、记录血小板与vWF相互作用的情况，为血小板各种生理功能的研究以及相关药物的研究应用创造条件。     

空间飞行与过氧化损伤

空间飞行与返回1G环境后的过氧化损伤密切相关，长期空间飞行损伤更为明显，着陆后这种效应甚至可持续几周。在人体表现为红细胞膜的脂质过氧化程度增加、某些血液中的抗氧化物含量减少，8-iso-prostaglandin和8-oxo-7，8-dihydro-2-deoxyguanosine的尿排出增加。8-iso-prostaglandin和8-oxo-7，8-dihydro-2-deoxyguanosine分别为脂质和DNA氧化损伤的标记物。上述改变应归结为飞行过程中出现的营养缺乏和恢复期急待补充营养的肌肉与其他组织对氨基酸的竞争等复合作用。对啮齿动物的研究极大地补充了人体观察结果。大多数啮齿动物实验表明飞行后脂质过氧化产物增加，而抗氧化酶活性下降，是由于返回地球重力时的应激反应。在食品中添加抗氧化物可减轻内源性氧化防御和氧化物合成之间的失衡，改善飞行后氧化应激状态。     

模拟微重力对大鼠嗜铬细胞瘤细胞蛋白酪氨酸硝基化的影响

目的研究微重力状态下活性氮自由基（RNS）对神经细胞蛋白质氧化修饰的影响。方法以大鼠嗜铬细胞瘤（PCI2）细胞作为神经细胞模型，利用水平轴回转器模拟微重力效应。回转72h后，对回转和对照组细胞进行一氧化氮合酶和硝基酪氨酸的免疫细胞化学染色分析，同时采用硝酸盐还原酶偶联法测定回转PC12细胞的一氧化氮（NO）水平，竞争性ELISA方法定量检测细胞硝基酪氨酸的水平。结果回转后PC12细胞诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和硝基酪氨酸免疫细胞化学染色均增强。回转后PCI2细胞NO水平升高（P〈0．01），蛋白质酪氨酸硝基化程度显著增加（P〈0．01）。结论模拟失重可诱导PC12细胞NO的合成，增加蛋白质氧化损伤程度。     

模拟微重力对大鼠嗜铬细胞瘤细胞形态及其生长的影响

目的研究回转是否影响PC12细胞内蛋白质的羰基化和硝基化水平,进而影响细胞骨架和形态;细胞内活性氮水平升高是否会影响PC12细胞的增殖分化。方法观察并测定了静置对照组和回转组细胞的细胞形态和细胞密度的变化,采用免疫荧光标记和RT—PCR技术研究了回转对细胞骨架蛋白Actin羰基化和Tubulin硝基化以及nNOS和iNOS的mRNA和蛋白表达的影响;并利用流式细胞术检测了细胞周期的改变,初步探讨了这些改变和一氧化氮合酶之间的关系。结果细胞骨架蛋白发生硝基化和羰基化的改变,但回转组细胞骨架形态变化不明显,PC12细胞的微丝回转后明显伸长;回转后,细胞密度显著增加,细胞周期中DNA合成的S期明显缩短。结论结果表明水平回转模拟微重力并不改变PC12细胞形态,相反还有利于细胞的生长,其机制可能与一氧化氮合酶的表达上调有关。     

表达血小板膜糖蛋白GPIb—IX复合物的中国仓鼠卵巢细胞株研究模型的建立

本研究旨在建立表达重组野生型和突变型血小板膜糖蛋白GPIb—IX复合物的中国仓鼠卵巢（Chinese Hamster Ovary,CHO）细胞研究模型,为进行GPIb-Ⅸ生理功能的相关研究奠定基础。从表达野生型或缺失突变型GPIbα的大肠杆菌宿主茵中抽提质粒并用EcoRI酶切鉴定,然后将分别表达GP／bα、GPIbβ和GP／X3种基因的质粒共转染到中国仓鼠卵巢细胞中,通过免疫共沉淀、Western blot和流式细胞仪检测其表达效果。结果表明,转染48小时后,CHO细胞裂解物和细胞表面均可检测到GPIb-Ⅸ复合物的表达。结论：成功构建了表达血小板膜糖蛋白GPIb—IX复合物的CHO细胞研究模型。     

抗硝基酪氨酸单克隆抗体的制备与鉴定

硝基酪氨酸 (nitrotyrosine ,NT)为活性氮 (reactivenitrogenspecies,RNS)对蛋白酪氨酸残基氧化修饰的产物 ,是体内RNS形成的重要生物标记物[1,2 ] 。目前 ,NT的检测主要采用HPLC、HPLC EC及GC MS等方法 ,需要大型仪器和专业人员操作 ,并需进行样品的预处理 ,费时费力 ;而且样品的处理过程还会人为地产生NT ,影响检测结果的准确性[3 ,4] 。免疫学技术为检测NT开辟了一条新的途径 ,将NT与载体蛋白的连接物作为免疫原 ,制备针对NT的mAb ,然后用于ELISA、Westernblot、免疫组化染色和免疫电镜研究。用ELISA法定量测定NT时 ,…     

模拟失重及力负荷对大鼠胫骨骨液流的影响

目的 采用体内分子示踪方法观察尾吊大鼠胫骨骨陷窝小管液流改变及施加力负荷后的变化。方法 36只SD雄性大鼠分3组：自由活动组，悬吊组，悬吊 力负荷组。实验第21天，每组选4只大鼠尾静脉注射辣根过氧化物酶(HRP)溶液，3h后断头处死大鼠，取胫骨冰冻切片，染色后观察HRP反应产物在骨组织的分布情况。结果 悬吊组大鼠骨陷窝染色反应物沉积量明显少于自由对照组；力负荷组大鼠骨陷窝反应物沉积量明显多于悬吊组。结论 模拟失重条件下，大鼠骨陷窝小管液体流动受到了一定程度的抑制，短时间一定强度的力负荷刺激，可促进其液体流动，增加骨对模拟失重效应的对抗性。     

微重力条件下细胞电融合研究进展

生物分离、细胞培养和细胞电融合是目前在空间条件下研究的主要生物过程.空间微重力环境是细胞电融合技术的理想场所,由于不存在重力和对流的影响,使电融合技术得到了改善.在提高杂交瘤得率、培植新品种和研究微重力细胞生物学效应方面具有广阔的应用前景.本文综述了微重力条件下细胞电融合的研究进展,细胞电融合过程中细胞骨架发生的变化,以及微重力条件下提高融合效率潜在的原因.