结核分枝杆菌Lsr2蛋白原核重组表达及其多克隆抗体制备

目的 利用原核系统获得重组结核分枝杆菌Lsr2蛋白,制备抗Lsr2多克隆抗体。 方法 以临床标准株 H37Rv DNA为模板,合成引物PCR扩增Lsr2核酸序列,插入原核表达载体pET28a,转化大肠杆菌Rosetta(DE3),经IPTG诱导表达,柱上复性纯化后,重组蛋白免疫新西兰大白兔,制备并纯化抗Lsr2多克隆抗体,采用间接ELISA和Western-blotting实验对抗体进行验证。 结果 成功构建pET28a-Lsr2表达质粒,重组蛋白Lsr2经SDS-PAGE电泳鉴定分子量为14 kD。亲和层析及柱上复性后,纯化的重组蛋白纯度在95%左右。制备的抗Lsr2多克隆抗体效价在1:5.5×10⁶以上,并能特异性识别纯化的重组蛋白和结核分枝杆菌菌体蛋白。 结论 成功在原核系统内表达并纯化了重组结核分枝杆菌Lsr2蛋白,制备了高效价的抗Lsr2多克隆抗体,为进一步研究Lsr2蛋白的功能,筛选其下游相互作用蛋白以及相关分子机制研究奠定了基础。     

吸烟对不育症男性精液质量的影响

目的 探究吸烟对不育症男性精液质量的影响。方法 选取360例男性不育症患者,根据患者是否吸烟进行分组：吸烟组（n=190）和未吸烟组（n=170,N组）,其中吸烟组按照吸烟量分为A组（≤10支/d组,n=63）、B组（11～20支/d组,n=80）、C组（>20支/d组,n=47）。观察并进行组间、组内比较各组患者精液量、液化时间、精子浓度、活动力、DNA碎片率以及正常形态率。结果 吸烟组和未吸烟组精液量、液化时间、精子活动力、正常形态率以及DNA碎片率比较差异均有统计学意义（P <0.05）,吸烟组患者精液量、精子活动力以及正常形态率低于未吸烟组,DNA碎片率、精液液化时间高于未吸烟组。且随着吸烟量增加,精子活动力以及正常形态率下降,精液液化时间、DNA碎片率增加;吸烟组和未吸烟组精子浓度比较差异无统计学意义（P>0.05）。吸烟量不同的3个组精液量比较差异无统计学差异（P>0.05）。结论 吸烟对精液量、精子活性、正常形态率、精子活动力、液化时间及DNA碎片化等精子质量参数造成负面影响,大量吸烟影响尤为明显。应该加强全面健康教育、提倡健康的生活方式、减少吸烟...     

自噬在结核病免疫应答中的作用

结核病是一个重要的公共卫生问题.据世界卫生组织报告,全球有20亿人感染MTB,其中活动性肺结核患者2000万例[1].我国约有5.5亿人感染MTB,据估算活动性肺结核患者约450万例,这提示仅有5％ ～ 10％的MTB感染者罹患结核病.近年来的研究结果表明,自噬能直接清除细胞内的MTB,在结核病先天性和获得性免疫应答中起着突出作用[2-4],从而有可能成为治疗性疫苗的靶标.我们对自噬的研究进展综述如下.     

人巨细胞病毒pp150-gp52蛋白原核可溶性表达与IgM捕获ELISA方法建立和应用

目的原核系统内表达并纯化巨细胞病毒pp150-gp52融合蛋白优势抗原表位,建立IgM捕获ELISA方法并应用。方法通过重叠PCR技术扩增获得巨细胞病毒pp150-gp52优势片段核酸序列,在原核系统内可溶性表达DsbC-pp150-gp52融合蛋白并纯化,用Western blot和ELISA检测融合蛋白的特异性和应用价值。结果纯化获得的融合蛋白DsbC-pp150-gp52经酶标记建立IgM捕获ELISA方法,检测60份临床阳性血清和60份健康人血清。其中以酶标记DsbC-pp150-gp52蛋白建立的捕获ELISA法阳性检出率96.7% ,阴性检出率100%,初步验证DsbC-pp150-gp52融合肽具有非常好的抗原特异性。结论融合蛋白DsbC-pp150-gp52在大肠埃希菌中以可溶性表达形式存在,获得的高纯度重组融合蛋白具有抗原性和特异性强的特点,采用IgM捕获ELISA的实验方法,可开发检测试剂盒用于风疹病毒的早期检测。     

DsbC介导HCV优势抗原表位原核可溶性表达与间接ELISA分析

目的 DsbC蛋白与丙型肝炎病毒(HCV)优势抗原表位原核融合表达并纯化,获得一种特异优良的HCV血清抗体诊断抗原。方法 通过生物信息学软件,筛选我国HCV主要流行株优势抗原片段并进行串联融合形成组合肽命名为P367,将P367与DsbC蛋白进行融合后在原核系统内可溶性表达并纯化获得重组抗原DsbC-P367,建立HCV-IgG血清学检测方法,通过对HCV阴阳性血清的检测,评价DsbC-P367与P367在血清学诊断差异,获得一种新型HCV-IgG血清学诊断抗原制作方法。结果 通过信息学软件筛选获得的优势抗原表位来源于不同基因型,全长367个氨基酸。通过原核表达系统发现,DsbC-P367以可溶性表达形式存在,亲和纯化后其相对分子质量为63×10³,纯度为92%,Western blot实验初步证实重组DsbC-P367与P367蛋白均具有抗原性;对100份明确HCV阴阳性血清进行检测,DsbC-P367与P367灵敏度分别为96%、90%,特异度均为100%,与“金标准”比较,McNemer检验显示均P=1.00,Kappa分别为0.95、0.87,提示DsbC...     

孕产妇-出生缺陷生物样本库建设质量控制要点

目的以我院样本库建设的运行经验为基础阐述孕产妇-出生缺陷生物样本库建设各环节质量控制要点。方法孕产妇生物样本库依托"建立出生人口队列开展重大出生缺陷风险研究"国家重点专项项目的建设同步进行管理。结果孕产妇生物样本库的建设有助于"出生缺陷预防"研究的开展。结论通过样本库各环节质量控制,不断完善样本库的建设,为孕产妇及出生缺陷相关疾病研究提供有力支撑。     

HPV16型L1蛋白优势表位原核表达及其血清学验证

目的利用原核系统对人乳头瘤病毒(HPV)16型L1蛋白优势抗原表位进行重组表达与纯化,并检测血清学反应。方法对HPV16型L1蛋白优势抗原表位进行全基因合成,将核酸片段克隆至pET-DsbC原核表达载体,重组质粒转化大肠埃希菌Rosetta(DE3),经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,采用亲和层析对表达产物进行纯化,采用免疫印迹法、酶联免疫吸附试验(ELISA)验证重组蛋白的免疫学活性。结果成功构建了pET-DsbC-HPV16 L1表达载体,并在大肠埃希菌Rosetta(DE3)中实现了稳定的可溶性表达。重组DsbC-HPV16 L1蛋白经亲和层析进行纯化,相对分子质量为45 000,纯度为95%,重组蛋白纯化得率为22%。免疫印迹法结果显示,重组DsbC-HPV16 L1蛋白可与HPV16型阳性血清产生特异的抗原-抗体反应,与重组DsbC蛋白或健康人血清无交叉反应,具有良好的特异性。ELISA结果显示,重组DsbC-HPV16 L1蛋白与HPV16型阳性血清有较强的免疫反应性,A450 nm均值为0.56,高于健康人血清和磷酸盐缓冲液(PBS)阴性对照(A450nm均值分别为0.24和0.21)。结论采用原核表达系统实现了HPV16型L1蛋白优势抗原表位的可溶性高表达,获得的重组蛋白具有良好的免疫原性和免疫学活性。     

Hsp90与SIRT1相互作用对肺癌细胞发生EMT的调控作用

目的:探讨热休克蛋白90(Hsp90)与沉默信息调节因子2同源蛋白1(SIRT1)的相互作用及其对肺癌A549细胞发生上皮-间质转化(EMT)的影响。方法:采用5 μg/L转化生长因子-β1(TGF-β1)作用于肺癌A549细胞建立EMT模型,分为对照组和TGF-β1组;采用免疫共沉淀法检测肺癌A549细胞中Hsp90...