RhoA、RhoC串联RNA干扰载体的构建及在结直肠癌细胞中的表达

目的 探讨RhoA、RhoC串联RNA干扰载体的构建及在结直肠癌细胞中的表达.方法 设计合成4对靶向RhoA与RhoC基因的各两对寡核苷酸序列,退火后分别克隆入shRNA表达载体;通过一系列的酶切与连接,将该4段干扰片段串联起来,构建一个同时表达4个shRNA的重组质粒.经酶切和测序鉴定重组质粒.脂质体法转染HCT116,荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测各细胞中RhoA、RhoC mRNA的表达,噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞的增殖活性.结果　经酶切和测序证实重组质粒pGenesil2.7-A1+A2+C1+C2构建成功.转染该重组质粒后细胞中RhoA、RhoC mRNA的表达水平分别为(0.78±0.11)和(0.90±0.21),明显低于空白对照组(0±0.15、0±0.09)和阴性对照组(-0.05±0.12、0.11±0.10,P＜0.05),且细胞的生长增殖率(63.8±12.5)%也显著低于对照组和质粒对照组(101.6±13.7)%(P＜0.05).结论　成功构建4个shRNA串联的重组表达载体,该载体可在体外高效表达.

Abstract：

Objective To construct and identify recombinant RhoA and RhoC shRNAs Tandem expression vector pGenesil2. 7-A1 + A2 + C1 + C2 and observe its expression in human colorectal carcinoma cells HCT116. Methods Four pairs of hairpin-like oligonucleotide sequences special for human RhoA or RhoC gene were designed and synthesized. The annealed oligonucleotide fragments were subcloned into four plasmids each with a different promotor. Then the four oligonucleotide fragments were series connected to construct an efficient multiple shRNAs expression system. The tandem array multiple shRNAs expression vector was confirmed by enzyme digestion and DNA sequencing and then was transfected into HCT 116 usingLipofectamneTM 2000. The expression of RhoA or RhoC mRNA was detected by fluorescence quantitative polymerase chain reaction (FQ-PCR). Cellular proliferation inhibitory activity was determined by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assay. Results Enzyme digestion and DNA sequencing showed that the oligonucleotide fragments were correctly inserted into pGenesil2. 7-A1 + A2 + C1 + C2 plasmid. After transfection, the expression of RhoA or RhoC mRNA was (0.78 ±0. 11)or (0.90 ±0.21) ,significantly lower than that in control group (0 ±0. 15、0 ±0. 09) and plasmid control group ( -0. 05 ±0. 12、0. 11 ±0. 10)(P＜0. 05) ,and the proliferation rate (63. 8 ± 12. 5)% was also lower as compared with control group and plasmid control group ( 101.6 ± 13.7 ) % ( P ＜ 0. 05 ). Conclusion The recombinant tandem array multiple shRNAs expressing vectors can effectively silence the expression of RhoA or RhoC in human colorectal carcinoma cells.     

机械通气患者拔管后吞咽障碍危险因素分析及护理对策

目的 探讨机械通气患者拔管后吞咽障碍的发病率、危险因素并提出相应的护理对策.方法 应用标准吞咽功能评定量表(SSA),对158例机械通气患者拔管后24h内进行吞咽评估,并根据有无吞咽障碍将患者分为两组,有吞咽障碍的为观察组,无吞咽障碍的为对照组,对两组患者的多个可能影响因素进行单因素分析和logistic多元回归分析.结果 拔管后吞咽障碍发病率为55.1％,单因素分析表明,观察组患者的年龄、带管时间、机械通气时间及气管切开情况与对照组比较均有统计学意义(P＜0.05).回归分析显示,年龄、气管切开、带管时间＞72h是拔管后吞咽困难的危险因素.结论 拔管后吞咽障碍发病率较高,而患者的年龄、气管切开及带管时间＞72h与拔管后吞咽障碍密切相关,提示对该类患者应采取相应护理措施,提高患者吞咽功能,减少并发症.     

RhoA、C干扰载体的构建及其对直肠癌HCT116细胞相应基因表达的影响

目的 构建RhoA和RhoC干扰载体,观察其对结直肠癌细胞内RhoA和RhoC基因表达的抑制作用.方法 设计合成针对人RhoA和RhoC基因序列的各4对含有小发夹结构的寡核苷酸序列,将其连入pGensil-1质粒中,构建特异性shRNA表达载体并转染结直肠癌细胞HCT116.应用荧光定量PCR法检测HCT116细胞中的RhoA和RhoC mRNA.结果 成功构建了特异性shRNA表达载体,将其转染HCT116细胞后,细胞内RhoA和RhoC mRNA的表达水平与未转染组相比,P＜0.05.结论 构建的RhoA和RhoC shRNA干扰载体能有效抑制HCT116细胞的RhoA mRNA和RhoC mRNA表达.     

直肠癌术后下肢深静脉血栓形成的原因及其防治

回顾分析56例直肠癌术后下肢深静脉血栓形成(LDVT)患者的发生原因及治疗方法.认为直肠癌术后LDVT的发生主要与多因素引起的血流速度缓慢和血流凝固性增加有关,其防治要点是针对病因,加强围术期处理,早期诊断,及时治疗.     

机械通气患者拔管后吞咽障碍及危险因素分析

目的:研究机械通气患者拔管后吞咽障碍的发病率并探讨相关危险因素.方法:64例机械通气患者于拔管后48 h内进行电视X透视吞咽功能检查,依据检查结果分为两组,对两组患者的多个可能影响因素进行单因素分析和Logistic多元回归分析.结果:拔管后吞咽障碍发病率为67.2％.单因素分析显示,吞咽障碍组患者的年龄、带管时间、机械通气时间及气管切开均与正常组有显著差异(P＜0.05).Logistic回归分析表明,两组中仅年龄＞ 65岁,气管切开有统计学差异.结论:拔管后吞咽障碍发病率较高,年龄＞65岁、气管切开是拔管后吞咽障碍的独立危险因素.     

标准吞咽功能评估在拔管后误吸筛查中的应用

目的探讨标准吞咽功能评估(SSA)在机械通气病人拔管后误吸筛查中的应用价值。方法对59例机械通气病人进行SSA筛查和电视X线透视吞咽功能检查(VFSS)。以VFSS为金标准,计算SSA对拔管后误吸诊断的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值。比较SSA筛查阳性病人和阴性病人的肺炎发生率。结果SSA对拔管后误吸诊断的灵敏度为86.7%,特异度为65.4%,阳性预测值为74.3%,阴性预测值为80.9%。14例隐匿性误吸病人中有11例SSA筛查为阳性。SSA阳性病人的肺炎发生率高于SSA阴性病人(χ2=3.67,P0.05)。结论 SSA用于机械通气病人拔管后的误吸筛查具有较高的灵敏度和特异度,并对误吸性肺炎有良好的预测价值。     

胃肠道恶性肿瘤术后肺栓塞防治体会

目的探讨胃肠道恶性肿瘤术后肺栓塞的病因、诊断、治疗及预防。方法回顾性分析2001年6月至2010年1月收治的35例胃肠道恶性肿瘤术后肺栓塞的病例资料。结果 35例均行D-二聚体检查,阳性率为100%;行螺旋CT肺动脉造影32例,30例异常。行持续吸氧、抗凝等治疗后治愈出院24例;行呼吸机辅助呼吸、溶栓抗凝等治疗后好转出院6例,因呼吸衰竭死亡4例,好转后因切口严重感染脓毒症死亡1例。结论胃肠道恶性肿瘤及其手术治疗是肺栓塞的高危因素;D-二聚体检查结合螺旋CT肺动脉造影有助于肺栓塞的快速诊断;溶栓、抗凝治疗能减轻肺血管阻塞,是挽救胃肠道恶性肿瘤术后肺栓塞病人的有效方法。