血管力学生物学研究进展

正2011年春天,我在美国加州大学圣迭戈分校(UCSD)短期访问学习期间有幸第一次拜访了冯元桢先生。还记得当天的天气是圣迭戈典型的阳光明媚,可是让我感触更为深刻的是冯先生睿智的思想、爽朗的笑声和对生物力学学科的热爱!冯先生和我讲到了论语中的"吾日三省吾身:为人谋而不忠乎?与朋友交而不信乎?传不习乎?",先生对于中华文化和思想的理解与践行都深深地打动了我。     

细胞核与应力信号转导

<正>力学生物学关注力学因素在生命体发生、发展、衰老和病变过程中的重要作用,而细胞如何感知力学刺激并将力学信号转化为生物化学信号、进而调控细胞功能是力学生物学的关键科学问题。深入探讨这一问题对于了解机体生理稳态的本质、揭示病理重建(重塑)的机制和疾病的临床防治均具有重要的理论意义和转化价值。研究显示,细胞膜表面存在多种力学感受器(mechanosensor),受到应力(应变)刺激后通过翻译后修饰或构型变化开启细胞内级联的信号网络,     

TNF-α促进内皮源性微体的数量与ICAM-1表达

目的探讨高张应变调控的肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)对内皮源性微体(endothelial microparticles,EMPs)数量与表面细胞间黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)表达的作用。方法采用Flexercell细胞张应变加载系统对大鼠胸主动脉内皮细胞(endothelial cells,ECs)分别施加5%(模拟正常生理状态)和18%(模拟高血压状态)幅度的周期性张应变,加载频率均为1.25 Hz,加载持续时间为24 h,实时PCR检测不同幅度张应变条件下ECs的TNF-αmRNA表达水平。之后应用TNF-α刺激大鼠胸主动脉ECs,收集上清液,超速离心提取得到内皮源性微体(endothelial microparticles,EMPs);用亲脂性苯乙烯基(lipophilic styryl)以及透射电镜对EMPs进行形态鉴定;流式细胞术对TNF-α刺激产生的Annexin V阳性EMPs进行计数,并检测EMPs表面ICAM-1的表达。结果与5%正常张应变组相比,18%高张应变条件下ECs的TNF-α表达水平显著上升。TNF-α能够显著上调ECs产生Annexin V阳性的EMPs数量,且TNF-α刺激ECs产生的EMPs表面ICAM-1表达量显著增加。结论高张应变条件下ECs高表达TNF-α可能介导了EMPs产生和表面ICAM-1高表达。研究结果为后续探讨EMPs在血管重建力学生物学机制中的作用提供新的实验证据。     

细胞联合培养杯膜的孔径对血小板源性生长因子通透的影响

目的 探讨细胞联合培养杯膜的孔径对生物大分子通透的影响,解决血管细胞分子力学生物学实验的关键技术问题。方法 以杯底PET膜孔径为0.4 μm和1.0 μm的两种型号细胞联合培养杯作为研究对象,将大鼠血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells, VSMCs）和内皮细胞（endothelial cells, ECs）分别种植于联合培养杯底PET膜的内外侧面。实验分为EC/VSMC联合培养施加低切应力组、PET膜未接种细胞静止组、PET膜单侧接种细胞静止组和PET膜双侧接种细胞静止组。ELISA检测低切应力组ECs侧和VSMCs侧培养液中血小板源性生长因子（platelet-derived growth factor BB, PDGFBB）含量,Western blotting检测重组PDGF-BB（rPDGF-BB）刺激后,各组细胞内信号转导分子p-ERK1/2和p-Akt以及核骨架蛋白Lamin A的表达变化。结果 EC/VSMC联合培养施加0.5 Pa层流低切应力12 h后,0.4 μm联合培养杯VSMCs侧PDGFBB浓度显著高于ECs侧。0.4 μm和1.0 μm两种孔径的PET膜未接种细胞时,rPDGF-BB上调了隔开培养细胞的pERK1/2和p-Akt表达,并下调Lamin A表达。PET膜外侧面接种单层细胞时,rPDGF-BB上调了对侧细胞的p-ERK1/2和p-Akt表达,并下调Lamin A表达。PET膜内外侧面均接种细胞时,rPDGF-BB仅能影响0.4 μm PET膜同侧细胞的pERK1/2、p-Akt和Lamin A表达,对对侧细胞无明显作用;而1.0 μm PET膜两侧细胞的p-ERK1/2、p-Akt和Lamin A表达无显著性差异。结论 两种有孔PET材料本身均允许生物大分子的通透,而细胞接种会影响有孔PET膜对生物大分子的通透。0.4 μm孔径PET膜两侧均接种细胞时,对生物大分子的通透明显减弱,更接近于在体情况。     

ROCK1及其相关信号分子参与张应变调控的血管平滑肌细胞增殖

目的探讨Rho相关卷曲蛋白激酶1(Rho-associated coiled-coil containing protein kinase 1,ROCK1)及其相关信号分子在感受张应变机械刺激、调控血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)增殖功能中的作用。方法应用张应变加载系统对体外培养VSMCs施加牵张幅度10%、频率1.25 Hz生理性周向张应变;Brdu检测VSMCs增殖水平;Western blotting检测力学加载后VSMCs的ROCK1表达水平以及蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)α/βII、蛋白激酶D(protein kinase D,PKD)、胞外信号调节激酶(extracellular regulated protein kinase,ERK)磷酸化水平;采用RNA干扰技术(RNA interference,RNAi)检测ROCK1对VSMC增殖和PKCα/βII、PKD、ERK磷酸化的调控作用。结果 10%生理性张应变加载12、24 h显著抑制VSMCs的ROCK1表达,并显著抑制PKD和ERK的磷酸化;10%生理性张应变加载12 h显著抑制PKCα/βⅡ的磷酸化,但加载24 h PKCα/βⅡ的磷酸化与静止对照组相比无显著差异。RNAi抑制VSMCs的ROCK1表达后,VSMCs增殖水平显著降低,同时PKCα/βⅡ和PKD磷酸化水平显著降低,但ERK磷酸化无明显变化。结论 10%生理性张应变可能通过抑制ROCK1表达调控PKCα/βⅡ和PKD的磷酸化水平,从而影响VSMCs增殖,维持血管稳定性。探讨张应变力学刺激调控血管细胞功能的细胞内信号转导网络,对心血管生理和疾病病理机制研究具有一定意义。     

Rho蛋白解离抑制因子α在高血压大鼠胸主动脉的表达

目的 研究高血压大鼠胸主动脉以及周期性张应变刺激下血管平滑肌细胞(VSMCs)的Rho蛋白解离抑制因子(RhoGDIα)的表达变化,探讨血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)信号通路对其表达的调控影响. 方法 应用实时PCR和Western blotting技术分别检测4周、12周和18周自发性高血压大鼠(SHR, n =4)和正常血压京都种鼠(WKY, n =4)胸主动脉RhoGDIα mRNA和蛋白的表达;免疫组织化学检测RhoGDIα在SHR和WKY胸主动脉的定位;Western blotting技术检测腹主动脉缩窄性高血压大鼠(ACR, n =6)胸主动脉RhoGDIα蛋白的表达;应用细胞应变加载系统对大鼠胸主动脉VSMCs施加1Hz、10%的周期性张应变,在有或无血管紧张素亚型Ⅰ(AT1)受体拮抗剂 L-158809的条件下观察周期性张应变刺激对VSMCs RhoGDIα蛋白表达的影响. 结果 4周与12周SHR和WKY胸主动脉RhoGDIα表达无显著性差异,而在18周组,SHR胸主动脉RhoGDIα表达显著高于WKY.RhoGDIα主要存在于血管中膜VSMCs.2周和4周ACR胸主动脉RhoGDIα表达较正常对照组显著上调,提示在高血压状态下的主动脉RhoGDIα的表达上调.10%周期性张应变加载抑制了VSMCs的RhoGDIα表达,加入ATI受体拮抗剂后RhoGDIα表达显著低于10%周期性张应变加载组. 结论 大鼠高血压时主动脉RhoGDIα表达上调;Ang Ⅱ信号通路在RhoGDIα表达调控中起重要作用.     

周期性机械牵拉通过上调Runx2表达促进MC3T3-E1细胞迁移

目的 探究周期性牵拉对小鼠胚胎成骨细胞MC3T3-E1迁移功能的影响及其相关机制。方法 使用应变加载系统对体外培养的MC3T3-E1细胞施加15%幅度的牵拉,模拟细胞体内受力情况。使用划痕愈合实验检测MC3T3-E1细胞的迁移功能,使用蛋白免疫印迹法检测Runx2表达情况,使用RNA干扰技术特异性降低Runx2表达量。结果 幅度15%、频率1.25 Hz、持续24 h的周期性机械牵拉可以促进MC3T3-E1细胞的迁移,升高细胞内Runx2表达水平。在静态培养条件下,干扰Runx2能抑制MC3T3-E1细胞的迁移。干扰MC3T3-E1细胞中Runx2表达可以部分降低机械牵拉对细胞迁移的促进效应。结论 周期性牵拉可以促进MC3T3-E1细胞的迁移,在此过程中Runx2可能发挥重要作用。研究结果为寻找促进骨折愈合的创新临床治疗方法提供实验依据。     

活化激酶C受体1在切应力调控血管平滑肌细胞增殖中的作用

目的 探讨活化激酶C受体1（receptor for actived C kinase 1, RACK1）在内皮细胞（endothelial cells, ECs）感受切应力刺激调控血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)增殖中的作用及其机制。方法 应用平行平板流动腔系统,对联合培养的大鼠ECs和VSMCs施加1.5 Pa正常切应力（normal shear stress, NSS）和0.5 Pa低切应力（low shear stress,LowSS）,应用BrdU ELISA方法检测VSMCs增殖水平,对蛋白质组学研究发现的力学响应分子RACK1表达以及Akt磷酸化,应用Western blot技术进行检测。静态条件下,应用RNA干扰技术特异性抑制VSMCs的RACK1表达,检测其对细胞增殖和Akt磷酸化的作用。应用ECs与VSMCs隔开培养和联合培养模型,检测ECs对VSMCs的RACK1表达和Akt磷酸化水平的影响。结果 血管差异蛋白质组学的结果发现,与NSS组相比,RACK1在LowSS组血管组织的表达水平明显升高。细胞实验结果显示,LowSS诱导了与ECs联合培养的VSMCs增殖,上调VSMCs的RACK1表达和Akt磷酸化。静态条件下,特异性抑制VSMCs的RACK1表达后,VSMCs的增殖水平和Akt磷酸化水平均显著下降。与ECs联合培养VSMCs,其RACK1表达和Akt磷酸化水平较隔开培养组均上调。结论 VSMCs的RACK1表达受细胞接触与切应力的影响,并可能通过PI3K/Akt信号通路参与LowSS诱导的VSMCs增殖的调控。探讨VSMCs增殖功能变化及其力学生物学机制对于认识动脉粥样硬化等疾病发病机理和疾病防治有重要意义。     

周期性高张应变通过下调 PGC1α 表达抑制血管平滑肌细胞线粒体生物发生

目的 探讨高血压背景下病理性高张应变对血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)线粒体生物发生的影响,以及PGC1α蛋白在这一过程中的作用。方法 采用Flexcell-5000T体外细胞张应变加载系统对VSMCs施加频率为1.25 Hz、幅度分别为5%和15%的周期性张应变,模拟正常生理情况和高血压病理情况下的力学环境;通过蛋白免疫印迹(Western blotting)和荧光定量PCR(qPCR)方法检测正常生理和高血压病理力学条件下VSMCs的PGC1α蛋白表达,以及柠檬酸合酶和线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)拷贝数变化情况;应用PGC1α特异性激活剂ZLN005和有效干扰片段siRNA检测PGC1α表达上调或下调对柠檬酸合酶和mtDNA拷贝数的影响。结果 与5%生理性周期性张应变相比,15%病理性高张应变显著抑制VSMCs的PGC1α和柠檬酸合酶的表达,mtDNA拷贝数显著降低。与对照组相比,对VSMCs转染PGC1α干扰片段siRNA或孵育PGC1α特异性激活剂ZLN005,分别下调和上调PGC1α蛋白...