靶向型辅助腺病毒的构建及其功能研究

目的构建一种新型辅助腺病毒,并用于靶向型第三代腺病毒载体的制备,提高其对造血细胞的感染效率。方法采用重叠PCR的方法合成含有不完全包装信号序列A1-A4和loxP序列的DNA片段SynES,替换穿梭质粒pShuttle中原有的包装信号序列,得到穿梭质粒pShuttle-SynES;将所得穿梭质粒与骨架质粒Ad5/F11p在大肠杆菌BJ5183中同源重组,获得重组腺病毒质粒载体pAd5/F11p-HV,将其转染293细胞包装重组腺病毒Ad5/F11p-HV。参照第三代腺病毒包装策略,利用Ad5/F11p-HV包装获得携带绿色荧光蛋白(GFP)基因的第三代腺病毒HD-Ad5/F11p-GFP;将其以不同的感染强度感染人白血病细胞系K562、U937、Jurkat和人脐带血CD34+细胞后,采用荧光显微镜和流式细胞术检测GFP的表达。结果采用DAN片段SynES替换穿梭质粒pShuttle上的包装信号,获得新的穿梭质粒pShuttle-SynES;进一步构建获得重组腺病毒质粒pAd5/F11p-HV,并制备了辅助腺病毒Ad5/F11p-HV。采用该辅助腺病毒包装pC4HSU-GFP,获得了第三代腺病毒HD-Ad5/F11p-GFP;CsCl密度梯度离心分离HD-Ad5/F11p-GFP和Ad5/F11p-HV,获得了高质量的HD-Ad5/F11p-GFP。与对照病毒HD-H14-GFP相比,HD-Ad5/F11p-GFP可明显提高对人白血病细胞U937、Jurkat和人脐带来源CD34+细胞的感染效率。结论设计并构建了一种靶向性辅助腺病毒,并以此为基础成功制备了对造血细胞高效感染的第三代重组腺病毒。     

重组腺病毒Ad5-KAI1对骨髓瘤细胞的功能调节作用

目的研究抗癌一号KAI1（又称CD82）基因对骨髓瘤细胞生物学特性的影响及机制。方法将携带KAI1基因克隆至重组腺病毒,制备Ad5-KAI1重组腺病毒,并感染骨髓瘤细胞SKO-007。Ad5-GFP作为阴性对照,未感染细胞为空白对照,利用CCK-8和AnnexinⅤ-PI等方法分别检测不同时间点（24 h,48 h）的细胞活率和凋亡水平。另外,利用W estern印迹方法检测不同组别细胞表达ERK及其磷酸化水平。结果 Ad5-KAI1组细胞活率抑制水平和凋亡水平明显高于对照组,且剪切型胱天蛋白酶（caspase）3、ERK磷酸化水平在实验组高表达,而抑制ERK磷酸化则导致凋亡进一步增加。结论 KAI1显著抑制骨髓瘤细胞增殖,并诱导其caspase依赖的凋亡;KAI1在促进凋亡的同时,其应激性诱导了ERK磷酸化,后者又对细胞具有保护作用。     

CD147与子宫内膜异位症的相关性研究

目的：探讨和比较免疫球蛋白超家族分子CD147在子宫内膜异位症患者异位子宫内膜、在位子宫内膜及健康人子宫内膜中表达及定位。方法：采用免疫组化方法对30例异位子宫内膜及其18例同期在位子宫内膜和15例健康人子宫内膜组织中的CD147的表达进行观察。结果：异位子宫内膜标本中CD147表达增强,以膜分布为主;而无论有无子宫内膜异位症,在位子宫内膜中CD147表达无差异。结论：CD147分子表达在异位子宫内膜和正常子宫内膜存在明显差异。CD147可能与子宫内膜异位症的发生密切相关。     

体外筛选抑制K562细胞生长的放线菌代谢物

目的：建立一种适合较大量微生物代谢物抑制K562细胞生长的体外筛选方法，筛选对K562细胞具有抑制作用，而对正常细胞Vero无明显抑制作用的土壤放线菌提取物。方法：放线菌培养液加入乙醇后，置于96孔板中。经过减压除去溶剂后，用MTT法检测各样品对K562及Vero细胞的抑制作用。结果与结论：从446种土壤放线菌提取物中筛选获得5种提取物对K562细胞具有明显的抑制作用，而对Vero细胞生长抑制作用较弱。     

MicroRNA-17-92 簇对 K562 细胞生物学特性的影响及机制初探简

本研究旨在探讨microRNA-17-92对K562细胞生物学特性的影响.以K562细胞系为模型,采用lipofectin2000转染miR-17-92 mimic,应用Q-PCR方法鉴定基因表达水平,CCK-8细胞增殖检测试剂盒检测K562细胞增殖活性,Annexin V-FITC/PI标记检测K562细胞的凋亡;细胞经过乙醇固定后利用流式细胞仪检测K562细胞周期变化,Western blotting检测相关蛋白Crk的表达.结果显示：K562细胞系转染miR-17-92 mimic后miR-17-92表达增高;miR-17-92高表达后K562细胞的增殖能力增强、在细胞周期方面由G1期向S期细胞增加;同时,miR-17-92 mimic能够抑制乏血清诱导的K562细胞凋亡;Western blot检测显示miR-17-92 mimic促进Crk蛋白的表达.结论：miR-17-92可以促进K562细胞增殖,抑制其凋亡并调控细胞周期变化.     

免疫组化法检测NSCLC骨髓微转移的临床研究

目的：探讨免疫组化检测非小细胞肺癌（NSCLC）患者骨髓微转移（BMM）的灵敏度、特异性及临床应用价值。方法：应用免疫组化法检测68例经病理检查证实的NSCLC患者骨髓（临床分期I－Ⅲ期53例，Ⅳ期15例）细胞角蛋白表达，诊断肺癌BMM。结果：免疫组化检测BMM的敏感度可达10^-5水平；I－Ⅲ期患者BMM阳性率为22．6％（12／53）；性别、年龄、卡氏评分、病理类型等因素对BMM阳性率无显著性影响；Ⅳ期患者BMM阳性检出率为53．3％（8／15），显著高于I－Ⅲ期患者。结论：免疫组化方法检测NSCLC患者的BMM具有较好的敏感性和特异性，适于临床应用。     

创伤合并γ射线照射后大鼠脾脏Treg/Th17平衡的变化及其意义

目的 观察创伤大鼠经SGy γ射线全身照射后伤口愈合情况及脾脏Treg/Th17平衡变化的特点,探讨两者之间的关系及意义.方法 清洁级雌性Wistar大鼠65只,按体重随机分为正常对照组(正常组)、单纯创伤组(单伤组)和创伤+5Gy γ射线全身照射组(伤照组).分别于伤照后1、3、7、14、21、28d,检测各组大鼠伤口残留面积及外周血白细胞和淋巴细胞计数,并采用流式细胞仪测定脾脏Treg细胞和Th17细胞亚群的变化.结果 伤照后7～21d伤照组伤口残留面积持续大于单伤组(P＜0.01),21d时单伤组伤口已基本愈合,而伤照组延迟至28d才基本愈合.单伤组伤照后1～ 7d外周血白细胞及淋巴细胞计数均明显低于正常组(P＜0.05,P＜0.01).伤照组1～14d时外周血白细胞及淋巴细胞计数均显著低于正常组和单伤组,21～28d时白细胞计数仍显著低于正常组和单伤组(P＜0.05,P＜0.01).伤照组大鼠脾脏Treg细胞仅在伤照后3d和7d高于正常组和单伤组(P＜0.01),而Th17细胞于伤照后1d即显著增高(P＜0.01),3d时升至最高,至28d时才恢复至正常组和单伤组水平.伤照组1～21d时Treg/Th17比值均显著低于正常组和单伤组(P＜0.01),至28d时恢复至正常组和单伤组水平.结论 5Gy γ射线全身照射可导致大鼠创伤愈合延迟,Treg/Th17平衡失调在其中可能发挥了重要作用.     

2 Gy γ射线照射对小鼠调节性T细胞和Th17细胞及其免疫平衡的影响

目的 观察2 Gy γ射线照射对小鼠Treg/Th17免疫平衡的影响。方法 50只C57BL/6雄性小鼠随机数字表法分为对照组和照射组,照射组小鼠接受2 Gy γ射线一次性全身照射(剂量率为164.94 Gy/min),对照组行假照射。于照射后1、3、7、14和28 d检测外周血象的变化;流式细胞仪分析外周血、胸腺及脾脏调节性T细胞(Treg细胞)和脾脏Th17细胞数量的改变。结果 受照后小鼠外周血白细胞总数和淋巴细胞数降低(t=8.89～33.54, P<0.05)。小鼠外周血Treg略有升高;胸腺Treg在照后1、3 d显著高于对照组(t=-6.45和-10.59, P<0.05),至28 d明显低于对照组(t=5.34, P<0.05);脾脏Treg在照后1～14 d显著高于对照组(t=-6.82～-3.89, P<0.05)。脾脏Th17细胞于照后1 d出现显著增高,3 d达到最大值(t=-2.42, P<0.05),较脾脏内Treg增长更为明显。Treg/Th17比值在照后1～14 d降低,差异有统计学意义(t=4.02～8.04, P<0.05),导致Treg/Th17平衡模式向Th17方向明显偏移。结论 Treg/Th17免疫平衡失调在辐射所致免疫功能损伤中可能扮演重要角色。     

γ射线照射后小鼠CD4+CD25+调节性T细胞的变化及其意义

目的 观察γ射线照射对小鼠CD4+CD25+调节性T细胞(Tregs)亚群的影响,探讨辐射诱发的免疫损伤作用机制.方法 C57BL/6小鼠经6 Gy γ射线照射后1～28 d取胸腺、脾脏称重并计算脏器系数,测量外周血WBC总数,流式细胞仪检测外周血和脾脏CD4+T细胞、Tregs细胞亚群的变化.结果 照射后1 d,胸腺和脾脏系数即明显下降,7 d降至最低,至照后28 d仍未恢复到对照组水平.WBC于照后1～7 d持续降至最低,14 d开始恢复,至28 d仍显著低于对照组.外周血CD4+T细胞在照后1 d-过性降低后逐渐增高,照后28 d基本接近对照水平;脾脏CD4+T细胞在照后7 d虽略有降低,但在14和28 d基本维持在对照水平.外周血Tregs细胞在照后1 d即开始升高,7 d达峰值,14和28 d仍明显高于对照组;脾脏Tregs于照后1 d即显著增至最高,而后缓慢降低,至照后28 d出现有统计学意义的降低(t=2.731,P＜0.05).结论 小鼠经6 Gy γ射线全身照射后胸腺和脾脏免疫组织严重受损,免疫细胞数量减少;而具有免疫抑制作用的Tregs细胞比例照后明显增高,揭示该亚群与辐射所致的小鼠免疫功能受抑和免疫调节失衡密切相关.

Abstract：

Objective To observe the effect of γ-ray irradiation on CD4 + CD25 + regulatory T cells (Tregs),and to investigate the mechanism of immune injury induced by irradiation.Methods The thymus and spleen of C57BL/6 mice were taken and weighted 1-28 d after γ-ray irradiation,and the organ coefficients were calculated.The amount of mouse peripheral WBC measured,CD4 + T cells and Tregs in peripheral and splenic were analyzed by flow cytometry.Results Coefficients of mouse thymus and spleen decreased significantly 1 d post irradiation,and reached to the bottom at 7 d.Coefficients did not recover to control level 28 d after radiation.Peripheral WBC continuously decreased and reached the bottom at 7 d,and did not recover to control level up to 28 d postirradiation.Peripheral CD4 + T lymphocyte temporally reduced at 1 d,while it increased at 7 d,and it approached to control level at 28 d after radiation.Splenic CD4 + T cells slightly reduced at 7 d however,they basically maintained as the same level as control 14 d and 28 d after radiation.Peripheral Tregs ascended at 1 d and reached the peak at 7 d,and reduced at 14 d and 28 d postirradiation,although they still were significantly higher than those of control group.At the same time,splenic Tregs increased significantly and achieved peak value at 1 d,and then gradually decreased and reached the minimum at 28 d after irradiation,which were significantly lower than those of control group( t =2.731,P ＜ 0.05).Conclusions Mouse thymus and spleen were injured severely,and the number of immunocytes decreased after 6 Gy whole body γ-ray irradiation.However,Tregs with immunosuppressive action increased significantly postirradiation,revealing that Tregs were closely correlated with immune function depression and immunomodulation imbalance induced by ionizing radiation.