借助慢病毒将EGFP基因导入西藏小型猪胎儿成纤维细胞

目的借助慢病毒将EGFP基因导入西藏小型猪胎儿成纤维细胞(porcine embryonic fibroblasts,PEFs),以基于PEFs建立慢病毒介导的外源基因体外投递系统。方法取35d西藏小型猪胚胎,酶消化法分离培养西藏小型猪的PEFs;按Invitrogen公司推荐的标准程序进行慢病毒(携带EGFP基因)包装(脂质体介导的瞬时转染),随后用病毒上清感染PEFs,24～48h后荧光显微镜下观察是否见绿色荧光以证实慢病毒是否成功生产和成功感染PEFs。结果成功分离培养西藏小型猪的PEFs,按标准程序生产的携带EGFP基因慢病毒高效率感染西藏小型猪的PEFs。结论针对西藏小型猪的PEFs建立了相应的慢病毒介导的外源基因体外投递系统,为相关后续研究打下了良好基础。     

高复制HBV转基因小鼠模型对抗乙型肝炎病毒药物的效应研究

 目的：研究高复制HBV转基因小鼠模型对抗乙肝病毒药物的效应评价。 方法： 选用抗乙肝药物拉咪呋啶、大剂量重组乙肝蛋白疫苗、α-1b型干扰素和RNA干扰在转基因小鼠进行药效及作用机制评价。 结果：拉咪呋啶、重组乙肝疫苗、α-1b型干扰素均可使HBV转基因小鼠血清中HBV DNA滴度显著降低。其中后两者还可提高机体脾细胞IL-2和IFN-γ的水平及使分泌IFN-γ脾细胞Elispot斑点数明显增加。将RNA干扰表达载体pU6-siHBV质粒尾静脉注入小鼠体内。注射后5 d血清HBsAg下降56.7%,抑制作用持续14 d。肝脏免疫组化显示HBcAg阳性细胞明显减少，但血清HBV DNA定量无明显降低。 结论： 本近交系高复制HBV转基因小鼠模型对抗乙肝药物药效学评估是可靠、可行的。     

西藏小型猪胚胎成纤维细胞的分离培养及性别鉴定

目的探索和建立西藏小型猪胚胎成纤维细胞体外分离培养及性别鉴定的技术方法。方法取35d的西藏小型猪胚胎分离胚胎成纤维细胞,进行体外原代培养及传代培养,观察细胞成纤维细胞的形态和生长状况。根据猪Y染色体上性别决定基因SRY设计引物进行性别鉴定,同时以β珠蛋白作为内参基因,建立PCR反应体系鉴别胚胎的性别。结果西藏小型猪胚胎成纤维体外分离后,呈贴壁生长,快速增殖。PCR性别鉴定结果表明雄性胚胎细胞可扩增出一特异性SRY基因条带,而雌性则没有。该法可快速鉴定胚胎的性别,可用于体细胞克隆动物早期性别鉴定。结论研究结果表明利用胶原酶消化法所获得的西藏小型猪胚胎成纤维细胞可在体外稳定培养并传代,利用PCR鉴定猪胎儿性别具有简单、快速、准确的特点,可应用于克隆猪研究中体细胞系的早期性别鉴定。     

复制型HBV（ayw）转基因小鼠血清中病毒颗粒的免疫电镜检测

目的检测复制型HBV（ayw）转基因小鼠血清中HBV病毒颗粒。方法应用密度梯度离心收集病毒颗粒并应用免疫电镜检测。结果发现了直径22nmHBsAg颗粒和45nm左右的Dane颗粒。结论本转基因小鼠模型能继续复制，组装并分泌HBV病毒颗粒。     

西藏小型猪Leptin及其受体胞外区片段的克隆及原核表达

目的 克隆及原核表达西藏小型猪瘦素(Leptin)成熟肽及瘦素受体胞外区片段.方法 根据西藏小型猪瘦素序列(GenBank号:GQ240885.1)和猪瘦素受体基因胞外域序列(GenBank号:AF167719.1)分别设计并合成两对引物扩增瘦素、瘦素受体基因胞外域编码区1654-2319位片段,以西藏小型猪组织总RNA为模板,经反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法获得了特异性片段.再以该两个特异性片段为模板,另外设计两对带有BanH Ⅰ和HidⅢ酶切位点的套式引物分别扩增瘦素64-504位(成熟肽编码区)和瘦素受体基因胞外域编码区1655-2314位的cDNA片段,将该两片段克隆入pMD<,18>-T载体并转化感受态细菌E.coli DH5α测序并永久保存.此两片段经酶切后克隆到表达载体pRSET A的BamH Ⅰ和HindⅢ两酶切位点之间,构建重组质粒pR-OB和pR-OBR-a并在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中表达,SDS-PAGE电泳鉴定表达产物.结果 在IPTG诱导下促使重组菌pR-OB表达了相对分子质量约18×10<'3>左右的融合蛋白;重组菌pR-OBR-a表达了相对分子质量约27×10<'3>左右的融合蛋白.结论 说明重组质粒pR-OB、pR-OBR-a在大肠杆菌BL21(DE3)中分别可表达西藏小型猪瘦素成熟肽、瘦素受体片段蛋白,为进一步研究瘦素、瘦素受体功能和应用提供了基础.     

HBV基因在第20代HBV转基因小鼠中的复制和表达

目的研究HBV基因在已传20代BALB／c-TgN（HBV D型1．3）SWS458小鼠中复制和表达情况。方法采用PCR荧光定量检测法、ELISA检测和免疫组化的方法研究HBV基因在转基因小鼠体内的复制和表达情况。结果F20代BALB／c-TgN（HBVD型1．3）SWB458小鼠血清HBVDNA为（104—106）copy／mL，HBsAg表达量为（124．41±33．46）ng/mL，preS1和HBcAg的OD值分别为0．248±0．076和0．635±0．338。肝组织有HBsAg和HBcAg表达，且HBsAg为胞浆型，HBcAg为核型。结论经过筛选和培育，本转基因小鼠传至20代时HBV基因复制表达稳定，表明我们已经获得一个传代表达稳定的HBV转基因小鼠品系。     

西藏小型猪胚胎成纤维细胞的分离培养及性别鉴定

目的探索和建立西藏小型猪胚胎成纤维细胞体外分离培养及性别鉴定的技术方法。方法取35 d的西藏小型猪胚胎分离胚胎成纤维细胞,进行体外原代培养及传代培养,观察细胞成纤维细胞的形态和生长状况。根据猪Y染色体上性别决定基因SRY设计引物进行性别鉴定,同时以β珠蛋白作为内参基因,建立PCR反应体系鉴别胚胎的性别。结果西藏小型猪胚胎成纤维体外分离后,呈贴壁生长,快速增殖。PCR性别鉴定结果表明雄性胚胎细胞可扩增出一特异性SRY基因条带,而雌性则没有。该法可快速鉴定胚胎的性别,可用于体细胞克隆动物早期性别鉴定。结论研究结果表明利用胶原酶消化法所获得的西藏小型猪胚胎成纤维细胞可在体外稳定培养并传代,利用PCR鉴定猪胎儿性别具有简单、快速、准确的特点,可应用于克隆猪研究中体细胞系的早期性别鉴定。     

复制型乙型肝炎病毒转基因小鼠血清中病毒颗粒的免疫电镜检测

HBV感染具有种属特异性,只感染人及黑猩猩等灵长类动物,因而使乙型肝炎的研究缺乏理想的实验动物模型。随着转基因技术的发展,国内外一些学者已建立了各种类型的HBV转基因小鼠模型,为乙型肝炎的研究提供了实验模型。刘光泽等应用受精卵显微注射成功建立了HBV转基因小鼠,并应用血清学、免疫学及分子生物学等技术检测到HBV DNA的表达。我们应用免疫电镜技术检测转基因小鼠中HBV病毒的形态及数量,更直观的证实这一转基因小鼠模型。一、材料与方法     

C基因型HBV转基因小鼠的制备

目的: 建立C型HBV转基因小鼠,为乙肝防治研究提供实验动物模型.方法: 采用受精卵显微注射法,制备HBV转基因小鼠,用PCR,ELISA,荧光定量PCR和免疫组化的方法研究HBV基因在转基因小鼠体内的整合、复制和表达情况.结果: 注射受精卵2840枚,筛选注射后成活的受精卵共2256枚,注射成活率79.4%.注射后受精卵共移植假孕雌鼠85只,其中有42只怀孕,假孕雌鼠妊娠率49%,共产下F0代小鼠168只,PCR检测共有14只小鼠阳性,其中ELISA检测血清HBsAg阳性5只,HBeAg均阴性.荧光定量PCR血清HBV DNA显示,2只小鼠的拷贝数分别为3.12×105copies/L,1.98×105copies/L,经传代产下F1代小鼠61只,PCR检测HBV DNA阳性5只,ELISA检测HBsAg阳性4只,其中肝脏HBsAg免疫组化阳性2只,HBcAg均阴性,且肝组织表达HBsAg为胞浆型.结论: 构建的C型HBV基因不但可以在转基因小鼠体内进行复制表达,而且可以遗传给下一代小鼠.