A族链球菌(GAS)Fba蛋白单克隆抗体对应表位核心氨基酸的确定

目的:对A族链球菌Fba蛋白McAb2所对应的表位进行定位.方法:以初步定位的表位区段为线索合成三段重叠多肽,dot-ELISA检测McAb2与合成肽的亲合力,并以McAb2为靶分子,利用噬菌体随机七肽库进行亲和筛选,用竞争ELISA鉴定阳性克隆.结果:dot-ELISA检测结果表明Fba_(100-112)肽段与McAb2的结合能力最强.经过3轮亲和筛选后,随机挑选20个噬菌体克隆,竞争ELISA对其与McAb2的亲和力做检测,其中12个克隆显示较强的阳性结果.阳性克隆DNA测序,与Fba基因第100位氨基酸至110位氨基酸中ITPDL同源性较高.结论:通过dot-ELISA将A族链球菌Fba蛋白McAb2对应的表位定位于100～112位氨基酸,结果同噬菌体随机肽库筛选的核心氨基酸位置吻合.为进一步研制表位肽疫苗、研究Fba蛋白及其单克隆抗体的生物学功能奠定了基础.     

A族链球菌表面蛋白Fba单克隆抗体的制备及其对应表位的初步鉴定

目的：制备抗A组溶血性链球菌（GAS）表面蛋白Fba（fibronectin-binding proteins a）的单克隆抗体（mAb）,并对单抗的生物学功能及其相应表位进行了初步鉴定。方法：以重组Fba蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠,运用杂交瘤技术及间接ELISA筛选出针对Fba的杂交瘤细胞株,以Western blot鉴定mAb的特异性,并将获得的mAb与Fba＋GAS和Fba-GAS分别行全菌ELISA、与Fba的分段表达蛋白行Western blot,初步鉴定mAb针对的表位所在区域。结果：获得了稳定分泌抗Fba-mAb的杂交瘤细胞株,其中一株mAb能特异结合天然Fba＋链球菌,且该单抗针对的表位包含了Fba蛋白的第104-108位氨基酸,该位点也是链球菌Fba蛋白结合补体调节蛋白FH的位点。结论：成功地制备了抗GAS表面Fba蛋白的mAb,其中一株mAb对应的表位为位于菌体表面的天然表位,并检测出了该mAb对应的表位所在区段,这为深入研究GAS的致病机制提供了有力工具。     

A族链球菌表面蛋白Fba保护性区段的鉴定

目的 将A族链球菌表面蛋白Fba分段克隆、表达,免疫动物并攻毒,以鉴定各区段诱导的保护性免疫并确定保护性最强的区段.方法 根据Fba蛋白的结构特点将其划分为4个重叠区域,以A族链球菌(GAS)的SSI-9为模板,PCR扩增4段蛋白的基因,克隆、表达后,Western印迹鉴定蛋白表达.4段蛋白纯化后分别免疫小鼠,同时设PBS对照组.ELISA检测各免疫组血清IgG水平,并用致死量的GAS(M+Fba+)攻击免疫3次后的小鼠,计算各组保护率.数据行方差检验和Fisher精确概率法.结果 成功构建原核表达质粒pGEX-2T/FbaAl、pGEX-2T/FbaA2、pGEX-2T/FbaA3和pGEX-2T/FbaA4,成功表达了4段蛋白.Fba蛋白免疫小鼠后,实验组血清IgG随免疫次数的增加呈逐渐增高趋势.第3次免疫后,与PBS对照组比较,FbaA2蛋白组效价升高最为明显,达1∶102 400(F=1290.2,P<0.01).攻毒后,FbaA2蛋白组8只小鼠中有4只得到保护,FbaAl、FbaA3及FbaA4蛋白组各8只小鼠中,仅2只得到保护(P<0.05).结论 成功构建、表达了Fba分段蛋白;初步确定FbaA2段可诱导较强的保护性免疫应答.