血红素加氧酶-1显性负性突变体转基因小鼠模型的建立与鉴定

目的对泰泽病原体nested—PCR检测方法进行优化和应用研究。方法以感染泰泽病原体RJ株的大鼠肝组织作为阳性对照,按国标GB/T 14926．10—2008《实验动物泰泽病原体检测方法》间接免疫荧光检测fIFA）呈阳性的上海地区大鼠肝组织为材料,对本室已建立的泰泽病原体nested—PCR检测方法中的DNA抽提方法和PCR过程进行优化,并应用于22只免疫抑制实验动物的泰泽病原体检测。结果肝脏组织DNA以酚／氯仿抽提法为好;nested—PCR出现196bp的特异性条带,此方法的敏感性达1pg;产物纯化后进行测序比对分析显示,上海地区实验大鼠感染样品以及RJ株感染样品的序列均与Genbank中泰泽病原体16S rRNA（Genbank D14638．1）的同源性为100％。应用研究表明,22个样品中IFA检测阳性样品8个,阳性率为36．4％;Nested-PCR检测阳性样品13个,包含所有的IFA阳性样品,阳性率为59．1％。结论本方法灵敏度高,特异性强,经进一步应用改进后,可用于泰泽病原体的检测。     

血红素加氧酶-1重组载体的构建及在胃癌细胞中的初步研究

目的 构建人血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)及其突变体的真核表达载体,观察其在胃腺癌细胞中HO-1表达和活性变化,研究HO-1活性变化的胃腺癌细胞对顺铂抗药能力的变化,为进一步研究HO-1对肿瘤细胞影响机制奠定基础.方法 根据GenBank中HO-1 cDNA序列设计引物,调取基因并克隆人pcDNA3.1(+)质粒中,构建表达人野生型HO-1与突变型HO-1(HO-1G143H)的重组质粒.脂质体介导重组质粒转染胃腺癌细胞BGC823,用RT-PCR和Western印迹法分别检测细胞中HO-1 mRNA的表达和蛋白表达水平,体外测定HO-1活性变化,应用顺铂进行体外抗药性实验.结果 酶切鉴定和测序证实,HO-1真核表达载体构建成功;转染质粒后的BGC823,HO-1的mRNA和蛋白的表达水平明显上升;转入野生型质粒的细胞HO-1活性上升,转入突变型质粒的细胞HO-1活性下降;HO-1活性下降BGC823细胞抗顺铂杀伤能力增强.结论 构建了HO-1野生型与突变型真核表达载体;将其转入胃腺癌细胞,引起了HO-1的mRNA和蛋白表达的增加和活性变化;体外实验表明,HO-1活性下降的BGC823细胞抗顺铂能力增强.     

人血红素加氧酶-1的原核表达、纯化及其中和抗体的制备

目的 确定人血红素加氧酶-1(human heme oxygenase-1,hHO-1)在大肠埃希菌中的表达条件与纯化方法,利用纯化的蛋白制备具有中和活性的hHO-1多克隆抗体.方法 将hHO-1原核表达质粒pMW172/hHO-1转入大肠埃希菌菌株BL21,通过改变摇床转速、诱导剂IPTG浓度和培养时间确定hHO-1蛋白的最佳可溶性表达条件;利用超声破碎、高速离心、分级盐析、分子筛层析等方法纯化hHO-1蛋白,建立体外HO-1活性测定方法检测hHO-1蛋白的活性;利用纯化的hHO-1活性蛋白作为抗原免疫新西兰兔,制备多克隆抗体;利用ELISA方法和Western印迹技术分别测定抗体的效价和特异性,通过HO-1活性测定检测抗体的中和活性.结果 确定hHO-1最佳可溶性表达条件为:37 ℃、200 r/min培养3 h后,0.1 mmol/L IPTG诱导培养4 h.超声破碎菌体,上清经30%～40%盐析纯化及分子筛层析纯化,获得活性hHO-1蛋白,收得率为30.3%,纯化倍数为2.83倍,纯度为90 %.制备的抗hHO-1的兔血清效价达到10~6,并能中和掉46 % hHO-1的催化活性.结论 为hHO-1蛋白的表达和纯化以及多克隆抗体制备确立了可行的技术方案;获得了高纯度活性hHO-1蛋白及hHO-1多克隆抗体,为HO-1功能、结构研究,以及相关疾病研究奠定了基础.