伯氏疟原虫pbmag-1基因片段克隆及原核表达优化

目的 克隆并表达伯氏疟原虫pbmag-1基因cDNA片段。 方法 在GenBank中检索伯氏疟原虫编码基因pbmag-1部分cDNA序列, 设计特异引物， 经RT-PCR从伯氏疟原虫ANKA株扩增出该基因的部分cDNA片段。 以锚定Oligo dT引物反转录mRNA获得的cDNA为模板， 利用已知序列设计特异引物， 通过cDNA末端快速扩增(RACE)技术延伸pbmag-1 3′端未知的编码序列， 并将其克隆于原核表达载体后转入大肠埃希菌（E. coli）BL21-(DE3)-RIL 株, 经优化诱导条件， 表达了重组蛋白PbMAg-1并用其免疫小鼠。 结果 获得1 341 bp具有完整3′末端序列的pbmag-1基因片段, 其A/T含量为73%。以包涵体形式表达的重组蛋白免疫小鼠， 其血清抗体经蛋白质印迹（Western blotting）分析, 能特异性地识别伯氏疟原虫感染红细胞相对分子质量约为Mr 64 000的蛋白。 结论 获得重组蛋白PbMAg-1的3′端完整的pbmag-1基因cDNA片段, 为研究伯氏疟原虫PbMAg-1蛋白在鼠疟免疫反应中的作用奠定了实验基础。     

恶性疟疾疫苗M.RCAg-1与候选佐剂纳米乳配伍的免疫原性研究

为了评价纳米乳作为佐剂对恶性疟疾人工重组蛋白疫苗M.RCAg-1免疫原性的影响,将纳米乳佐剂与M.RCAg-1相配伍,于第0、14、28 d肌肉注射免疫小鼠,抗原量为20μg/只。第3次免疫后10 d,眼球取血并取脾细胞。采用ELISA法检测小鼠血清特异性Ig G抗体水平、抗体亚类及其对抗原单表位的识别,用间接免疫荧光反应(IFA)检测抗体对恶性疟原虫天然蛋白的识别,用ELISPOT法检测小鼠脾淋巴细胞免疫应答水平。结果显示疫苗佐剂组小鼠血清中抗M.RCAg-1的抗体水平可达1∶108;疫苗佐剂组产生的特异性Ig G抗体以Ig G1为主;疫苗佐剂组抗体对抗原单表位和天然虫体的识别效果显著。各表位和蛋白诱发免疫小鼠分泌IFN-γ的特异性淋巴细胞克隆数高于分泌IL-4的特异性淋巴细胞克隆数。结果提示纳米乳作为恶性疟疾疫苗M.RCAg-1的佐剂,能够显著提高机体的体液免疫和细胞免疫应答水平。     

早期胃癌浸润深度判断的研究进展

胃癌是最常见的恶性肿瘤之一,准确地判断胃癌的浸润深度对治疗方式的选择和预后的判断十分重要。目前,主要通过白光内镜、超声内镜来对早期胃癌的浸润深度进行预测,但其准确性有待提高。本文通过复习相关文献,对各种判断早期胃癌浸润深度的方法进行介绍,并对其优势与不足进行分析,以期能对临床实践提供帮助。     

活体电穿孔导入法增强恶性疟原虫核酸疫苗免疫反应研究

目的 采用活体电穿孔免疫方法,研究恶性疟原虫DNA核酸疫苗不同免疫剂量对于动物免疫反应的影响,并对载体中CpG寡脱氧核苷酸基序的免疫刺激活性进行了初步探讨。方法 将恶性疟原虫多表位嵌合抗原M.RCAg-1基因克隆于真核表达载体VR1012中,使用电穿孔导入方法免疫小鼠,采用ELISA检测抗体效价、ELISPOT测定细胞因子分泌水平,探索基因疫苗最佳免疫剂量以及考察免疫反应类型。使用计算机分析恶性疟核酸疫苗中特殊CpG基序组成,实验验证基因疫苗中CpG基序的免疫刺激活性。结果 相同DNA免疫剂量下,电穿孔免疫法与单纯肌内注射免疫法相比较,小鼠血清IgG抗体效价提高118倍,且能显著诱导体内特异性Th1和Th2型细胞反应。电穿孔免疫小鼠血清可识别天然虫体抗原,抗体效价可达1：1200。恶性疟原虫核酸疫苗抗原DNA含有24个CpG免疫活性基序,可以有效的刺激人外周血单个核细胞（PBMCs）增殖与IL-6分泌。结论 活体电穿孔方法可以显著提高恶性疟原虫DNA疫苗体液免疫和细胞免疫水平。     

探究获得高成熟率伯氏疟原虫裂殖体的体外培养条件?

为获得大量有活力的伯氏疟原虫裂殖体,本研究对伯氏疟原虫ANKA虫株的体外培养条件主要从培养基的用量、培养基胎牛血清的含量、培养的细胞浓度、培养时间及培养的气体环境等方面进行了优化。当小鼠体内虫血率达到1％～3％,在红内期疟原虫处于环期或早期滋养体阶段时取血分组培养,观察在不同培养条件下裂殖体的状态并检测其活力。与既往的体外培养方法相比,优化后的培养方法,可将裂殖体的成熟率提高到80％,每个裂殖体含12～16个裂殖子,裂殖体尾静脉注射重新入侵红细胞4 h后的虫血率为1?57％,与对照组相比裂殖体的活力提高3?4倍。优化的方法可以提高裂殖体的得量和活力,为伯氏疟原虫的转染奠定基础。     

人源miR-185通过靶向恶性疟原虫var基因减弱感染红细胞粘附作用的研究

为了探讨人源miR-185对恶性疟原虫var(pfl1955w)基因表达调控并观察感染红细胞粘附所受到的影响,体外培养293T细胞和恶性疟原虫3D7,构建双荧光素酶报告质粒和表达质粒,再分别利用Lipofectamine 2000转染293T细胞和Cytomix电转恶性疟原虫3D7,流式细胞仪检测转染效率,用双荧光素酶报告验证人源miR-185对var(pfl1955w)的dbl区域直接调控作用,Q-PCR检测var(pfl1955w)mRNA的表达,细胞粘附实验检测感染红细胞的粘附.结果显示,293T细胞和3D7的转染效率在50％以上,过表达人源miR-185可显著抑制含var(pfl1955w)dbl的荧光素酶基因的表达;在293T细胞和3D7中,人源miR-185能够减少var(pfl1955w)mRNA的含量,并使感染红细胞粘附作用下降了39％.结果表明,人源miR-185对疟原虫var(pfl1955w)基因表达有下调作用,进而影响恶性疟原虫的粘附.     

早期食管癌患者内镜下切除术后复发的危险因素及治疗现状

随着内镜技术的发展,内镜下切除术（ER）已成为治疗早期食管癌的首选方法。相比于外科手术,ER具有创伤小、愈合快、保留器官完整性等优点,患者的长期生存率与外科手术的患者相当,但肿瘤复发率相对偏高。因此,探究ER术后复发的危险因素对于复发风险的评估及后续治疗方式的选择尤为重要。目前对于ER术后复发的食管癌患者,多采取再次行ER或追加外科手术、放射治疗、化学治疗等。该文就早期食管癌患者ER术后复发的危险因素及治疗方法作一综述,以期为临床治疗提供参考。     

分泌型CTLA-4融合恶性疟原虫核酸疫苗联合GM-CSF增强小鼠免疫反应

目的研究分泌型细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)融合恶性疟原虫核酸疫苗联合粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)免疫对小鼠体液免疫和细胞免疫反应的影响。方法将疟原虫抗原编码序列与小鼠CTLA-4胞外区序列拼接构建真核表达载体VR1012-s ES312-CTLA,用Western blot检测转染HEK293细胞上清液蛋白表达。VR1012-s ES312-CTLA和小鼠GM-CSF的真核表达载体共同电穿孔法免疫Balb/c小鼠,ELISA检测疟疾疫苗特异性抗体Ig G效价以及ELISPOT方法分析细胞因子IFN-γ和IL-4的表达水平。结果疟疾DNA疫苗体系中引入CTLA-4分子以及GM-CSF佐剂能显著增强疫苗的特异性免疫反应。VR1012-s ES312-CTLA+GM-CSF联合免疫小鼠,抗体滴度比单纯的疟疾DNA疫苗VR1012-ES312相比提高190倍(P0.001)。结论将疟疾DNA疫苗改造为树突细胞靶向型,并在免疫体系中引入GM-CSF分子佐剂,显著增强了小鼠体液和细胞免疫效力。此结果为有效提高疟疾DNA疫苗免疫应答水平提供了新的思路。     

原核表达及一步法制备可溶性白喉毒素突变体CRM197

目的构建一种新型的重组蛋白大肠杆菌胞内自动切割表达系统表达可溶性的CRM197重组蛋白,实现一步法纯化。方法将CRM197编码序列与硫氧还蛋白(Trx)序列融合并克隆于原核表达载体p ET-32a(+)载体上,Trx与CRM197之间加入HRV3C(人鼻病毒3C)蛋白酶识别区序列和组氨酸纯化标签编码序列,HRV3C蛋白酶基因克隆于原核表达质粒p GArasd,共同转化大肠杆菌Origami B(DE3),15℃温和诱导,并使用Ni-NTA基质亲和纯化CRM197重组蛋白。结果 CRM197融合蛋白表达后,随即被伴随表达的HRV3C蛋白酶水解释放出游离的带His标签的CRM197重组蛋白,经过一步法亲和纯化,得到纯度约95%的CRM197样品。与DNA共同孵育,显示所获CRM197重组蛋白具有脱氧核糖核酸酶活性。结论通过构建新型的双质粒自动切割原核表达系统,简化了在大肠杆菌表达纯化可溶性CRM197重组蛋白的工艺,降低了制备成本。