蛋白磷酸酶4在棕榈酸降低人脐静脉内皮细胞eNOS Ser633位点磷酸化中的作用

目的:探讨蛋白磷酸酶4(protein phosphatase 4,PP4)在棕榈酸(palmitic acid,PA)引起内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)Ser633位点磷酸化水平降低中的调控作用。方法:选用人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)为研究对象,分别用终浓度为25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L和200μmol/L的PA处理HUVECs 36 h,另用100μmol/L PA处理HUVECs 12 h、24 h、36 h和48 h,用蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A,PP2A)家族抑制剂福司曲星(fostriecin,FST)20 nmol/L或冈田酸(okadaic acid,OA)5 nmol/L分别预处理细胞30 min,然后用蛋白磷酸酶4催化亚基(protein phosphatase 4 catalytic subunit,PP4c)小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)和蛋白磷酸酶2A催化亚基(protein phosphatase 2A catalytic subunit,PP2Ac)siRNA分别转染HUVECs。用Western blot法检测eNOS总蛋白、PP4c和PP2Ac蛋白表达水平及eNOS Ser633磷酸化水平,用DAF-FM DA荧光探针检测细胞内一氧化氮(nitric oxide,NO)的含量。结果:(1)与control组比较,PA(终浓度25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L和200μmol/L)处理HUVECs 36 h后,eNOS Ser633磷酸化水平均显著降低(P<0.05),100μmol/L PA处理HUVECs 24 h、36 h和48 h后eNOS Ser633磷酸化水平均显著降低(P<0.05);各组间eNOS总蛋白表达无显著差异。(2)与control组相比,FST和OA预处理均可逆转PA处理引起的eNOS Ser633磷酸化水平降低(P<0.05)和细胞内NO产量减少(P<0.05);各组间eNOS总蛋白表达无显著差异。(3)与siControl组相比,si-PP4c转染组PP4c蛋白表达水平显著降低(P<0.05),同时eNOS Ser633磷酸化水平显著增高(P<0.05);si-PP2Ac转染组PP2Ac蛋白表达水平显著降低(P<0.05),但eNOS Ser633磷酸化水平表达无显著差异;各组间eNOS总蛋白表达无显著差异。结论:PA可显著降低HUVECs中eNOS Ser633磷酸化水平及NO产量,其机制可能是由于PA诱导PP2A家族中的PP4而不是PP2A激活所致。     

AngⅡ/AT_1R通路下调内皮型一氧化氮合酶磷酸化的机制研究

目的:探讨血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)/血管紧张素Ⅱ1型受体(angiotensinⅡtype 1 receptor,AT_1R)通路通过激活蛋白磷酸酶2 A(protein phosphatase 2 A,PP2 A)导致大鼠肠系膜动脉中内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,e NOS)磷酸化水平下调的机制。方法:采用体重160~180 g成年雄性SD大鼠90只,在无菌条件下分离大鼠肠系膜动脉。首先明确AngⅡ下调大鼠肠系膜动脉中e NOS(Ser1177)磷酸化的效应,将肠系膜动脉随机分为正常对照(control)组和AngⅡ组,AngⅡ组用浓度为1×10~(-7)mol/L、1×10~(-6)mol/L和1×10~(-5)mol/L AngⅡ分别孵育离体大鼠肠系膜动脉血管6 h、12 h和24 h;然后进一步探讨AngⅡ使eNOS(Ser1177)发生磷酸化下调的分子机制,将肠系膜动脉随机分为正常对照(control)组、AngⅡ组和坎地沙坦(candesartan,CAN;AT_1R特异性抑制剂)+AngⅡ组(用1×10~(-5)mol/L CAN预处理大鼠肠系膜动脉血管1 h后,再用1×10~(-7)mol/L AngⅡ继续孵育12 h)。采用Western blot法检测肠系膜动脉中eNOS蛋白表达和eNOS(Ser1177)磷酸化水平,以及PP2Ac的蛋白表达、PP2Ac(Tyr307)磷酸化水平和PP2A内源性抑制蛋白I~2~(PP2A)的表达水平,并用PP2A活性检测试剂盒测定大鼠肠系膜动脉PP2A活性变化。结果:(1)与control组比较,AngⅡ孵育离体大鼠肠系膜动脉血管6 h、12 h和24 h后,eNOS(Ser1177)磷酸化水平均明显降低(P0.05),且12 h组和24 h组eNOS(Ser1177)磷酸化水平下降均出现明显浓度依赖性,但不同浓度组间eNOS蛋白表达水平差异均无统计学显著性;(2)与control组比较,1×10~(-7)mol/L AngⅡ孵育肠系膜动脉血管12 h后,eNOS(Ser1177)磷酸化水平降低(P0.05);CAN预处理可明显上调eNOS(Ser1177)磷酸化水平(P0.05),且各组间eNOS蛋白表达水平差异无统计学显著性;(3)与control组比较,1×10~(-7)mol/L AngⅡ孵育肠系膜动脉血管12 h后,PP2Ac(Tyr307)磷酸化水平和I_2~(PP2A)蛋白表达均降低(P0.05);CAN预处理可使PP2Ac(Tyr307)磷酸化水平和IPP2A2蛋白表达均增加(P0.05),但各组间PP2Ac蛋白表达的差异无统计学显著性;(4)与control组比较,1×10~(-7)mol/L AngⅡ孵育肠系膜动脉血管12 h后,PP2A活性增高(P0.05);CAN预处理可明显抑制AngⅡ对PP2A的激活作用(P0.05)。结论:AngⅡ可通过AT1R通路激活PP2A,从而介导大鼠肠系膜动脉eNOS(Ser1177)磷酸化水平下调,其分子机制可能与PP2Ac(Tyr307)磷酸化水平和PP2A内源性抑制蛋白I_2~(PP2A)表达降低有关。