一种新型肝癌免疫毒素的表达、纯化及初步鉴定

从噬菌体随机肽库中筛选获得了与肝癌细胞特异性结合的12-肽A54,将其与蜂毒肽(melittin,Mel)编码基因连接后,插入质粒载体pET-32a(+)中,构建成A54-Mel与硫氧还蛋白(thioredoxin,Trx)及六聚组氨酸(6×His)的融合表达载体pET32-A54-Mel。将重组质粒转化E.coliBL21(DE3)表达后,获得可溶性表达产物,经Western blot鉴定,表达产物能与蜂毒肽特异性抗体反应。表达菌经超声裂解后,上清液用Ni+离子亲和层析法纯化得到了融合蛋白(Trx-A54-Mel),经肠激酶裂解、再次Ni+离子亲和层析后得到纯度大于95%的肝癌特异性免疫毒素A54-Mel。经细胞ELISA和四氮唑盐(MTT)法检测,发现A54-Mel在体外具有一定的肿瘤细胞特异性靶向及杀伤活性,为新型免疫毒素在肝癌靶向治疗中的研究奠定了基础。     

新型肝癌免疫毒素A54-PE40KDEL的构建表达与活性鉴定

目的:构建新型肝癌免疫毒素A54-PE40KDEL的原核表达载体,诱导表达后检测其生物活性.方法:PCR扩增绿脓杆菌外毒素A PE40KDEL基因插入到pET32a(+),然后与合成的含有肠激酶酶切位点和肝癌特异性结合肽A54的核酸序列连接,构建重组表达载体pET32a(+)-A54-PE40KDEL,其经鉴定后转化E.coli BL21 表达.超声破菌,上清液经Ni+亲和层析纯化,肠激酶酶切,再次Ni+离子亲和层析后得到免疫毒素A54-PE40KDEL.MTT和间接免疫荧光技术检测其对不同细胞株的细胞毒性及靶向性.结果:重组质粒序列正确,经Western blot证实表达产物含Mr约58 000的目的蛋白.A54-PE40KDEL能够与肝癌细胞特异性结合,且对肝癌细胞的毒性作用与对照相比有极显著性差异(P＜0.01).结论:成功构建了A54-PE40KDEL原核表达载体;获得的新型肝癌免疫毒素A54-PE40KDEL在体外与肝癌细胞具有一定结合特异性及杀伤活性,为肝癌导向治疗提供了一条可行的途径.     

肝癌细胞特异性内在化肽的筛选和初步鉴定

应用噬菌体肽库技术筛选与肝癌细胞特异性结合并可以内在化的短肽,为肝癌的导向治疗奠定基础。以肝癌细胞株BEL-7404作为筛选靶细胞,对噬菌体展示随机12-肽库进行亲和淘选。经过3轮淘选后,共随机挑选出20个噬菌斑进行扩增和测序,同时用细胞ELISA检测其与肝癌细胞的结合情况,并通过免疫荧光术、流式细胞术等方法进一步鉴定噬菌体克隆对肝癌细胞的导向性及内在化的效果。结果表明3轮淘选所得的噬菌体回收率逐步提高,显示淘选过程对随机肽库有一定的富集效果。从扩增的噬菌体克隆中选择结合力最强的LJ08通过免疫荧光术、流式细胞术鉴定,结果显示LJ08与肝癌细胞呈特异性结合并内在化进入肝癌细胞。结论认为,通过对噬菌体随机肽库的筛选,得到可以与肝癌细胞BEL-7404结合并可以内在化的噬菌体肽,为该肽作为肝癌导向治疗的药物载体奠定基础。     

G蛋白偶联受体56胞外端融合蛋白的表达、纯化及其多克隆抗体的制备

目的:制备G蛋白偶联受体56(G protien-coupled recepter 56,GPR56)的高效抗体,为其功能及分子机制的深入研究提供灵敏、高效的免疫学检测工具。方法:以肝癌细胞株MHCC-97H的cDNA为模板,利用PCR技术扩增GPR56 N端序列(661~1 073 bp),并构建重组表达载体pGEX4T-1-GPR56N。阳性克隆经酶切、测序鉴定正确后,转化大肠杆菌BL21进行诱导表达。表达产物经Western blot初步鉴定后,用GST磁珠分离纯化,纯化后蛋白与免疫佐剂混合直接免疫家兔制备抗血清。阳性血清用ELISA、Western blot、免疫组织化学等技术对细胞或组织中的GPR56进行鉴定和分析。结果:成功构建重组表达载体pGEX4T-1-GPR56N,GPR56N与GST的融合蛋白(GST-GPR56)在原核系统中进行了高效的可溶性表达,制备的兔抗人GPR56抗体经Western blot和免疫组织化学分析结果表明,该抗体可同时对人源性和鼠源性的GPR56进行特异性检测。结论:成功对GPR56蛋白N端序列进行了原核表达和纯化,制备的抗GPR56多克隆抗体具有较高的特异性,为GPR56功能及分子机制的深入研究奠定了坚实的基础。