日本血吸虫硫氧还蛋白编码基因的克隆表达及其免疫原性研究

尽管近50年来我国在血吸虫病防治取得了令人瞩目的成就,日本血吸虫病仍然是我国一个重要的公共卫生问题。目前控制血吸虫病的措施仍以灭螺和吡喹酮化疗为主。治愈病人的再感染情况严重、血吸虫抗药虫株的出现及家畜和野生哺乳动物作为重要传染源是我国血吸虫病防治工作当前面临     

发育期慢性染铅大鼠脑组织中NO、SOD、MDA的变化及其相互关系

目的　观察发育期慢性铅染毒大鼠脑组织中一氧化氮 (NO)、超氧化物歧化酶 (SOD)、丙二醛 (MDA)的变化及其与血铅的剂量 -效应关系。方法　建立慢性铅染毒模型 ,隔日灌服醋酸铅 ,约 4周 ,观察各组血铅浓度与脑组织中NO、SOD、MDA的剂量 -效应关系以及NO、SOD、MDA 3者之间的相互关系。结果　 (1)实验组与对照组血铅浓度间差别有显著性意义 (P <0 0 0 1)。 (2 )随着血铅浓度的升高脑组织中NO、MDA均呈上升趋势 (相关系数分别为 0 80 4、 0 70 3)。 (3)NO与SOD之间为负相关 (γ =- 0 95 5 ,P <0 0 0 1) ,SOD与MDA之间为负相关 (γ =- 0 85 ,P<0 0 0 1) ,NO与MDA之间为正相关 (γ=0 935 ,P<0 0 0 1)。结论　大鼠在慢性染铅过程中可导致脑组织中NO含量上升 ,SOD活性下降 ,MDA含量升高且呈剂量 -效应关系 ,推测可能是由于铅中毒诱导了iNOS而使NO含量增加 ,而SOD的活力下降 ,使体内蓄积了大量的O2 ,NO与O2 反应的结果生成了过多的氧化性极强的物质 ,从而使中枢神经系统发生脂质过氧化反应而表现为明显的细胞毒性     

日本血吸虫硫氧还蛋白编码基因的克隆和表达

目的克隆和表达日本血吸虫大陆株硫氧还蛋白(SjcTrx)的编码基因。方法根据日本血吸虫菲律宾株硫氧还蛋白基因序列设计一对引物,上游引物引入BamHI酶切位点和起始密码子ATG,下游引物引入SalI酶切位点和终止密码子TAA。以日本血吸虫大陆株成虫总RNA为模板,经反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增SjcTrx基因。经双酶切并纯化的PCR产物与同样双酶切并纯化的pET28a质粒DNA片段用T4 DNA连接酶连接,构建重组质粒pET28a-SjcTrx,转化BL21感受态菌并大量扩增。重组质粒DNA经限制性内切酶双酶切、PCR、琼脂糖凝胶电泳和核苷酸序列测定进行鉴定。pET28a-SjcTrx/BL21用IPTG诱导表达。结果SjcTrx编码基因RT-PCR产物约334 bp,构建的重组pET28a-SjcTrx表达质粒DNA经限制性内切酶双酶切和PCR扩增产物于琼脂糖凝胶电泳均观察到相同大小基因片段。根据核苷酸序列测序结果推导的氨基酸序列与日本血吸虫菲律宾株和曼氏血吸虫Trx分别有97%和43%的同源性。表达的重组蛋白经SDS-PAGE分析,约14kDa。Western blotting显示该重组蛋白可被日本血吸虫感染兔血清和重组抗原免疫小鼠血清所识别。结论SjcTrx基因的表达获得成功,并获得纯化蛋白,为开展动物保护性免疫试验创造了条件。     

抗人RKIP单克隆抗体的制备及鉴定

目的：制备抗人RKIP（hRKIP）的单克隆抗体（mAb）并进行特性鉴定。方法：自行构建表达人RKIP重组蛋白（reRKIP）,纯化的reRKIP免疫BALB/c小鼠,按常规方法进行细胞融合。采用有限稀释法和间接ELISA法克隆和筛选阳性杂交瘤细胞株,用免疫荧光和Western blot鉴定mAb的特异性。结果：成功构建RKIP原核表达载体,转化BL21后可高效表达reRKIP,成功地获得4株（EC1,ED2,ED5和8B3）分泌抗人reRKIP mAb的杂交瘤细胞株,杂交瘤细胞培养上清分泌的mAb在免疫荧光和Westernblot试验中均可与细胞中RKIP蛋白反应。结论：成功地制备了4株抗hRKIP mAb,为进一步研究RKIP生物学功能奠定了基础。     

转移相关分子链Actin-CD44-MMP-2在乳腺癌转移实验中的改变

目的 研究乳腺癌转移相关的分子机制及抑制体内外转移的作用和机制.方法 选择高、低转移性乳腺癌细胞系BICR-H1和MCF-7,用明胶底物非变性电泳分析法、Western blot和免疫荧光染色等方法,观察肌动蛋白、CD44和基质金属蛋白酶2分子链(ACM)成员分子的定性与定位关系.利用荧光标记肿瘤鸡胚尿囊膜(CAM)模型,血管内注射顺铂或MMP-2C末端PEX融合蛋白,利用荧光显微镜直接观察鸡胚肺转移抑制情况与癌细胞的ACM水平.结果 高转移的BICR-H1细胞ACM分子链呈高表达,分子定位相互关联.低转移性的MCF-7细胞呈低表达或无表达.体外实验中,顺铂和PEX分别抑制了CD44和MMP-2的表达.体内实验中,5-30μg顺铂能够抑制BICR-H1和MCF-7肿瘤的体内生长,呈剂量依赖性.30μg顺铂使乳腺癌BICR-H1细胞体内转移克隆数下降到(8±6)个[对照组为(30±15)个],而同剂量PEX可以完全抑制其体内转移.结论 ACM分子链表达与乳腺癌的转移性密切相关.顺铂和PEX分别通过封闭ACM分子链的环节,使CD44或MMP-2表达抑制,从而抑制乳腺癌细胞的体内外生长和转移.     

RACE技术及其在寄生虫全长cDNA克隆中的应用

PCR技术的出现大大提高了传统基因分离和克隆效率。以PCR为基础的RACE(rapid anplification of cDNA ends)技术是一种简单、敏感且有效扩增cDNA的5′和3′端未知序列区域的方法。IRACE技术被广泛应用于克隆全长cDNA，该文主要概述RACE技术在应用策略上的改进和发展以及在寄生虫基因克隆方面的应用。     

Twist 促进人肝癌细胞的迁移*

目的：研究Twist对肝癌细胞迁移能力的影响。方法：RT-PCR 方法检测Hep-11和Hep-12中Twist的表达情况。将Twist-cDNA转染Hep-11筛选得到稳定高表达Twist的细胞克隆Twist-Hep- 11。构建pSuper-Twist-shRNA 干扰载体,瞬时转染Hep-12细胞。用Boyden 小室检测过表达和抑制Twist基因后对细胞迁移和侵袭能力的影响。RT-PCR 和Western blot检测Hep-11上调Twist后的EMT 标志分子的表达。结果：与Hep-11相比,Hep-12的Twist基因表达显著上调,Hep-12的迁移能力也强于Hep-11。Hep-11细胞过表达Twist后,其迁移能力明显增强;而干扰Hep-12细胞Twist表达后,其迁移能力亦明显下降。Hep-11过表达Twist后,N-cad、Vimentin 表达明显上调,E-cad 变化不明显。结论：Twist可以促进肝癌细胞的迁移,其机制可能与N-cad、Vimentin 表达上调有关。     

RACE技术及其在寄生虫全长cDNA克隆中的应用

PCR技术的出现大大提高了传统基因分离和克隆效率。以PCR为基础的RACE(rapidam plificationofcDNAends)技术是一种简单、敏感且有效扩增cDNA的 5′和 3′端未知序列区域的方法。RACE技术被广泛应用于克隆全长cDNA ,该文主要概述RACE技术在应用策略上的改进和发展以及在寄生虫基因克隆方面的应用     

曼氏血吸虫虫卵纤溶酶的识别及该酶对曼氏血吸虫感染鼠血纤维蛋白原代谢的调节作用

曼氏血吸虫虫卵提取物能抗血小板活化、凝集 ,从而抑制纤维蛋白原聚集形成纤维蛋白 ,抑制血栓形成。Doenhoff等从虫卵中分离出一种相对分子质量为 2 70 0 0的纤溶酶 ,并分析了该酶对曼氏血吸虫感染鼠血纤维蛋白原的代谢作用。选用波多黎各分离的曼氏血吸虫 ,制备尾蚴、成虫和虫卵及其提取物。取 10U血栓素 ,加至含 5 0mg人纤维蛋白原的10mlPBS中 ,混和液加至 10cm培养皿中 ,放入纤维素膜 ,膜表面分别加曼氏血吸虫尾蚴、成虫和虫卵提取物 ,37℃孵育 4h ,摄影观察结果 ,比较尾蚴、成虫和虫卵提取物和不同浓度人纤溶酶的溶解面积大小 ,检测血…     

Tet-on慢病毒调控系统的构建及其调控作用

Objective To establish Tetracycline-induced gene expression system for gene therapy based on third generation lentivirus system.Methods The mutant of the reverse Tet transactivator (rtTA and M2rtTA) was subcloned into a lentiviral vector with neo selection marker named as pELNS-rtTA-IRES-Neo and pELNS-M2rtTA-IRES-Neo. The Tet-responsive element (TETO and TREpitt) and green fluorescence proteint (GFP) were subcloned into a lentiviral vector with blasticidin selection marker named as plenti6-TETO-GFP and plenti6-TREpitt-GFP.293 cells were contransfect with pELNS-rtTA-IRES-Neo and plenti6-TETO-GFP, or with pELNS-M2rtTA-IRES-Neo and plenti6-TREpitt -GFP. Cells were treated by Dox to induce GFP expression. After 48hours, GFP expression in the co-transfected cells was observed under a fluorescent microscope.Results The first generation of Tetracycline-induced gene expression system named pELNS-rtTA-IRES-Neo and plenti6-TETO-GFP vectors were successfully set up. GFP expression in cotransfected cells induced with Dox was about 90% positive, while there was 30% positive GFP expression observed in no Dox inducing group. The second generation of Tetracycline-induced gene expression system named pELNS-M2rtTA-IRES-Neo and plenti6-TREpitt-GFP vectors were successfully set up. GFP expression in cotransfected cells induced with Dox was about 95% positive, while there was no positive GFP expression observed in no Dox inducing group.Conclusion Tetracycline-induced gene expression system based on lentivirus was successfully set up, which can induce gene expression effectively and tightly without obvious side-effects on cells by using the second Tetracycline-induced elements.