活化T细胞核因子对组成性启动子SV40的调控作用

目的:利用双荧光素酶报告系统探讨活化T细胞核因子(NFAT)能否调控常见组成性启动子CMV,SV40和TK,为不同条件下选择合适双荧光报告系统内参提供依据。方法:用限制性内切酶BglⅡ和HindⅢ分别从质粒pCDNA3.1和pRL-TK中切下CMV和TK启动子,克隆至pGL3-basic载体中,构建成pCMV-Luc和pTK-Luc载体。将构建pCMV-Luc和pTK-Luc以及商品化的pGL3-control(SV40启动子驱动),分别与SV40(pBIND)和TK(pRL-TK)两种启动子驱动的两种内参质粒共转染入HEK293细胞;观察过表达组成性活化NFAT后相对荧光素酶活性读数的改变。结果:成功构建了pCMV-Luc和pTK-Luc质粒,荧光素酶活性检测发现,常见组成性启动子SV40启动子对过表达组成性活化的NFAT存在一定的反应。结论:T细胞活化过程中重要的转录因子NFAT能够调控SV40启动子活性;表明常见组成性启动子SV40并非真正、绝对的组成性不变。因此,在荧光素酶报告系统内参选择时需要充分考虑该问题,本研究为合理选择内参质粒提供了一个可行策略。     

《基因工程》课程教学中注重科学思维培养的实践研究

《基因工程》是生物技术专业开设的一门必修的专业基础课程,对科学思维养成至关重要。为此,教学组在课程内容设置、教学策略、教学考核等方面进行了创新性探索。在教学内容设置方面尊重科学规律,集思广益,充分挖掘能够传递科学思维的教学元素;在实施过程中以历史为依据,通过情景重现启发和引导科学思维的形成;在教学考核中,增设讨论,将科学思维能力纳入考核。与往届学员相比,通过《基因工程》教学改革,学员的科学思维素质有了显著的提高。     

脂肪酸合酶与脂肪酸代谢及细胞因子的关系

脂肪酸合酶(FASN),是一种大分子蛋白复合物,在内源性长链脂肪酸的合成中发挥着重要作用.研究证实脂肪酸代谢障碍可导致细胞因子的释放紊乱,与许多疾病发生相关,FASN的异常表达与某些疾病的发生、发展密切相关,尤其是在代谢性疾病如:肥胖、胰岛素抵抗中扮演了重要角色.本文对FASN蛋白的结构、功能、表达调控,以及与相关疾病细胞因子的关系进行了总结.     

荧光内参在校正Caspase-3/7活性检测偏差中的应用

目的 改进Caspase-3/7活性检测方法.方法 在顺铂诱导的HeLa细胞凋亡模型中,分别利用传统的和改良的实验方法检测Caspase-3/7的活性变化,并与Western印迹实验结果进行方法学比较.结果 改良的实验方法显示不同剂量顺铂诱导下,HeLa细胞Caspase-3/7活性有剂量依赖性增高,与Western印迹实验结果相一致,但传统实验方法显示HeLa细胞Caspase-3/7活性呈现先增高后降低的趋势.结论 由于参测细胞数不同,导致这种Caspase-3/7活性检测方法不能真实反映细胞凋亡程度.本研究成功建立了一种新的改良型Caspase-3/7活性检测方式,这种检测方法可以排除不同凋亡诱导方式诱导细胞凋亡时所产生的因参测细胞数不同所造成的Caspase-3/7活性检测的误差.     

环氧合酶2 mRNA 3’UTR荧光素酶报告基因载体的构建

目的:通过构建环氧合酶2(COX2)mRNA 3’UTR的全长及其截短体荧光素酶报告基因载体,为研究COX2基因在炎症条件下的的转录后调控提供有效的工具。方法:通过从胃癌细胞SGC-7901提取RNA,反转录成cDNA后,以此为模板,PCR扩增COX2 3’非翻译区(3’-UTR)全长及截短的序列,并将该序列连接到荧光素酶报告基因载体pGL3-control,构建pGL3-COX2 3’UTR全长及pGL3-COX23’UTR不同截短体。测序后将上述载体分别与pRL-TK载体共转染293-T细胞,48 h后裂解细胞检测荧光素酶的活性。最后通过ELISA检测在IL-1β的刺激下COX2的下游产物PGE2的表达,并再次测定pGL3-COX2 3’UTR全长的荧光素酶活性。结果:成功构建了pGL3-COX2 3’UTR全长及pGL3-COX23’UTR不同截短体,荧光素酶报告系统表明COX2 3’UTR对基因表达具有较强的调控作用。而在炎症因子IL-1β的刺激下,pGL3-COX2 3’UTR全长荧光素酶的活性明显升高。结论:成功构建了COX2 mRNA 3’UTR荧光素酶报告基因载体并证明在IL-1β的刺激下COX2表达上调,参与转录后调控。     

RNA 结合蛋白 QKI 吸附海绵载体的构建及其对肝癌细胞增殖的影响

目的：构建针对 RNA 结合蛋白 quaking (QKI)的特异性吸附海绵载体(QRE-sponge),验证其对肝癌细胞系 HepG2中内源性 QKI 分子的抑制作用。方法利用人源 QKI 的特异性识别效应原件(qua-king responsive element, QRE)序列,重复13个拷贝,串联克隆至 pEGFP-C2真核表达载体中,转染 HepG2肝癌细胞及293 T 细胞。通过 Real time PCR,双荧光素酶报告基因检测及 MTT 实验进一步验证该吸附海绵的效果及其对肝癌细胞系 HepG2增殖的影响。结果 pEGFP-C2-QRE-SP 载体经测序证实构建成功,可以成功的在 HepG2细胞中表达,其绿色荧光呈阳性,且转染24 h 后显著影响 HepG2细胞中 QKI 下游靶基因的表达(P ﹤0.05)。双荧光素酶报告基因系统显示, pGL3-QRE-SP 载体可以显著抑制外源性 QKI 的活性(P﹤0.05)。 MTT 结果显示 pEGFP-C2-QRE-SP 载体促进 HepG2细胞的增殖。结论 QKI 吸附海绵载体策略构建的 pEGFP-C2-QRE-SP 载体可以成功的诱骗吸附 QKI,并促进肝癌细胞系 HepG2增殖,为进一步研究 QKI的功能研究提供了良好工具。