扎伊尔型、苏丹型埃博拉病毒TaqMan探针实时定量PCR核酸检测方法的建立

目的建立针对扎伊尔型(ZEBOV)及苏丹型埃博拉病毒(SEBOV)特异、灵敏和快速的Taq Man探针实时定量PCR核酸检测方法。方法选用世界卫生组织(WHO)参比实验室所使用的引物和探针序列,建立针对扎伊尔型及苏丹型埃博拉病毒的NP基因序列保守区的Taq Man探针实时定量PCR核酸检测方法,验证检测方法的灵敏性、特异性和稳定性,并与常规PCR检测方法进行比较。结果所建立的实时定量PCR方法可用于ZEBOV及SEBOV的特异性检测,较传统PCR方法反应快捷、灵敏,分别可达:ZEBOV 34拷贝/反应、SEBOV 24拷贝/反应;具有良好的特异性、稳定性和可重复性。结论建立了ZEBOV及SEBOV Taq Man探针实时定量PCR核酸检测方法,该方法可有望用于埃博拉病毒(EBOV)的实验室、临床及现场核酸检测。     

蜱传脑炎病毒prM-E蛋白的真核表达及其在荧光素酶免疫共沉淀技术中的应用?

为了探索一种新型的血清学技术的荧光素酶免疫共沉淀技术（LIPS）,本研究利用真核表达系统制备了蜱传脑炎病毒结构蛋白prM?E与荧光素酶融合蛋白,并评价了其在LIPS系统中的检测效果。首先以蜱传脑炎病毒RNA为模板,采用RT?PCR技术扩增prM?E抗原基因,连接到pNLF1?secN质粒上构建真核表达载体pNLF?prM?E,使prM?E蛋白与荧光素酶串联融合表达,并将该质粒转染到Cos7细胞中。结果显示,转染重组质粒pNLF?prM?E的细胞上清中可检测到荧光素酶的高表达;进而用间接免疫荧光试验（ IFA）检测到转染的细胞与蜱传脑炎病毒抗体特异性结合;在此基础上,用LIPS方法对蜱传脑炎病毒感染患者血清进行检测,从20份患者血清中检出19份阳性,7份对照血清均为阴性。结果表明该重组抗原具有良好的特异性和灵敏性,可以用于LIPS系统中的候选检测抗原。     

含5种烈性出血热病毒的假病毒阳性参考品的制备

目的：利用慢病毒载体系统制备含有马尔堡病毒（Marburg virus）、扎伊尔型埃博拉病毒（Zaire Ebola virus）、苏丹型埃博拉病毒（Sudan Ebola virus）、拉沙热病毒（Lassa fever virus）和黄热病毒（Yellow fever virus）5种烈性病毒核酸片段的假病毒,为其核酸检测提供一种通用的阳性参考品。方法体外合成该5种病毒的目的基因片段,通过融合 PCR 技术将5个片段连接成一条基因,然后克隆到慢病毒表达载体上,并与其辅助载体共转染293T细胞;转染后分别于48、72 h 收集培养上清,用 DNase 和 RNase 进行消化处理及纯化浓缩,最后提取核酸,利用普通PCR 和实时荧光定量 PCR 鉴定假病毒是否包装成功。结果测序结果表明,体外合成的该5种病毒的目的基因片段已正确连接并插入慢病毒载体中;载体转染293T 细胞后收集上清中的假病毒,提取核酸经上述两种 PCR 鉴定均可特异性检测到靶基因,表明已成功包装出含该5种出血热病毒靶基因的假病毒颗粒。结论该研究获得的假病毒颗粒可作为上述5种出血热相关烈性病毒核酸检测的通用阳性参考品。