YMDD突变株HBV转基因小鼠的制备及检测

目的建立YMDD耐药突变株HBV转基因小鼠,为乙肝防治研究提供转基因动物模型。方法采用受精卵显微注射法,将带有YMDD突变的对拉米夫定有耐药性的1.3拷贝HBV基因注入FVB/N单细胞受精卵的原核内,制备YMDD耐药突变株HBV转基因小鼠。采用PCR检测外源基因的整合和传代情况,采用ELISA和免疫组化等方法检测HBsAg在肝、肾中的复制和表达情况。结果注射受精卵3401枚,产269只F0代仔鼠,PCR阳性33只,外源基因的整合率12.3%。9只转基因鼠血清HBVDNA弱阳性,拷贝数低于103拷贝/ml;免疫组化结果显示肝组织和肾组织均有HBsAg表达,且肾组织中的表达强于肝组织。经传代产下47只F1代转基因鼠,目的基因PCR阳性率为27.6%,且肝组织和肾组织中HBsAg均有表达,分布特性与F0代一致。结论成功制备出体内有复制表达而且可以传代YMDD耐药突变株HBV的转基因小鼠。     

HBV转基因小鼠血液生理生化指标检测分析

目的研究HBV基因整合对转基因小鼠代谢和血液指标的影响。方法以28只同一窝乙肝表面抗原(HBsAg)阴性小鼠和50只HBsAg阳性的HBV转基因小鼠为研究对象,鼠龄6~8周,眼眶静脉丛采血,检测血液常规指标白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血红蛋白(Hb)、血小板(PLT)及淋巴细胞百分比(L%)、中间细胞百分比(M%)、分叶细胞百分比(G%),血液生化指标葡萄糖(GLU)、尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)、总蛋白(ALB)、白蛋白(ALB)、总胆红素(TBIL)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、总胆固醇(CHOL)、甘油三酯(TG)等,并对有差异的指标进行品种(HBsAg阳性鼠和阴性鼠)内及性别间比较分析。结果转基因小鼠血糖、尿素氮、肌酐、红细胞、血红蛋白、血小板指标与正常小鼠之间有显著差异(P<0.05),而其余指标无明显差异(P>0.05)。上述6项指标在不同性别正常小鼠之间没有差异,而在不同性别转基因小鼠之间仅血糖存在差异,雄鼠血糖高于雌鼠(P<0.05)。转基因雄鼠血糖、肌酐、尿素氮明显高于正常雄鼠,而转基因雌鼠红细胞、血红蛋白、血小板指标明显高于正常雌鼠(P<0.05)。结论 HBVDNA对小鼠的生理生化指标有一定影响。     

慢病毒介导的绿色荧光蛋白转基因小鼠的制备及鉴定

目的以携带绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒为载体制备转基因小鼠,建立慢病毒介导的转基因动物制备技术平台。方法将慢病毒表达载体FUGW与ViraPowerTMLentiviral Packaging Mix按1∶2比例混合,用LipofectamineTM2000转染293FT细胞,包装出的病毒经浓缩后以293T细胞测定病毒滴度。采用受精卵卵周隙显微注射的方式制备转基因小鼠。出生小鼠用PCR法检测GFP基因整合情况,并在荧光体视显微镜下鉴定外源基因的表达情况。结果病毒包装过程中,转染后24h即可见GFP表达,72h时293FT细胞的转染效率达95%以上,镜下可见大量绿色荧光。包装出的慢病毒滴度为106U/ml,经浓缩后可达108U/ml。PCR检测显示,F0代小鼠GFP PCR阳性率为70.27%(26/37)。荧光体视显微镜下观察荧光小鼠所占比例,F0代为65.2%(15/23),F1代为55.0%(11/20),荧光强度在两代个体中相当。F0代、F1代中GFP均呈广泛表达。结论制备出携带GFP可传代的转基因小鼠,建立了慢病毒载体介导的转基因小鼠制备技术平台。     

甜菜碱对老龄db/db小鼠脂肪性肝损害的影响

 目的：通过高脂饮食诱发db/db小鼠非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）模型,探索甜菜碱对遗传性小鼠脂肪肝脂质代谢的影响。方法：50只7月龄db/db鼠随机分为低、中、高剂量组、生理盐水对照组和阳性药物组。所有小鼠均饲以高脂饲料, 以诱发NAFLD 模型。 小鼠分别以200 mg/kg(低剂量组)、400 mg/kg(中剂量组)和800 mg/kg(高剂量组)甜菜碱溶液灌胃,连续6周。测定血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、甘油三酯(TG)、总胆固醇（TC）和低密度脂蛋白(LDL)水平,并行葡萄糖耐量测定和肝组织病理学观察。结果：甜菜碱可显著降低血清ALT、TC和LDL的水平(P<0.05或P<0.01)。组织学结果表明甜菜碱可显著减少小鼠肝细胞的脂肪样变性。结论: 甜菜碱可以显著改善老龄db/db小鼠的脂类代谢紊乱和肝功能,明显降低脂肪在肝细胞中的积蓄。     

抗乙肝病毒新药Bay41-4109在HBV转基因小鼠中的药效学研究

目的研究抗乙肝病毒新药Bay41-4109在HBV转基因小鼠体内的药效学作用。方法 SPF级TgM(HBV D1.3)小鼠分为Bay41-4109组[30mg/(kg.d)],拉米夫定组[30mg/(kg.d)]和溶媒组(0.5%羧甲基纤维素钠)3组,每组32只。利用免疫组化分析HBV转基因小鼠肝组织HBcAg变化,定量PCR技术研究HBV转基因小鼠肝组织HBV DNA及血清HBV DNA的变化,并从血清转氨酶及体重指标分析该药物体内作用的安全性。结果给药第50天,Bay41-4109组HBcAg阳性细胞核个数、阳性细胞核平均面积、光密度比值三项指标均明显低于溶媒组(P<0.05);用药第64天(停药2周),各组间上述三项指标均无统计学差异。拉米夫定组各时间点上述指标与溶媒组之间均无明显差异(P>0.05)。但Bay41-4109对肝组织及血清HBV DNA未见明显作用。该药未对HBV转基因小鼠血清转氨酶及体重产生明显影响。结论 Bay41-4109可有效抑制HBV转基因小鼠肝组织HBcAg表达,且效果优于拉米夫定。Bay41-4109是一种安全性较好的抗乙肝新药,其作用机制不同于拉米夫定。     

Cre重组酶调控的OVA-HBsAg转基因乙肝模型小鼠的制备及鉴定

目的 制备Cre重组酶调控的卵清蛋白(OVA)-HBsAg转基因小鼠,为乙肝的防治提供更好的动物模型.方法 采用原核显微注射方法将线性化的携带OVA-HBsAg基因并带有LoxP位点的质粒注入C57BL/6J×DBA小鼠受精卵的雄原核内,制备受Cre重组酶调控表达的OVA-HBsAg转基因小鼠.将F1代OVA-HBsAg阳性母鼠与本室饲育的Alb-Cre转基因阳性公鼠进行杂交,获得子代小鼠,观察Cre对OVA-HBsAg转基因小鼠HBsAg的诱导表达情况.采用PCR、ELISA和免疫组化方法检测HBsAg基因、Cre基因在转基因小鼠体内的整合及表达情况.结果 共注射受精卵491枚,成活337枚,成活率68.6％.产下F0代小鼠29只,其中PCR阳性4只,外源基因整合率13.8％.目前已传至F4代,F1-F4代PCR阳性率分别为27.5％、32.0％、22.9％、25.0％,ELISA法未检测到血清中HBsAg表达.将F1代OVA-HBsAg阳性母鼠与Alb-Cre阳性公鼠杂交,获得16只子代小鼠,PCR检测Cre基因和HBsAg基因双阳性的子代小鼠有6只,其中2只小鼠血清HBsAg检测为阳性,诱导表达阳性率为33.3％.结论 成功制备出OVA-HBsA转基因小鼠,且可稳定传代,Cre重组酶可以诱导小鼠体内HBsAg的表达.     

复制型HBV转基因小鼠肝组织HBcAg分布特性分析

目的探讨复制型HBV转基因小鼠肝组织HBcAg的分布特性。方法通过图像分析软件，对转基因小鼠的肝组织HBcAg在肝内不同区域以及肝细胞核内的表达与分布进行系统和量化分析。结果①HBcAg在复制型HBV转基因小鼠肝组织内高表达，弥散分布，主要为胞核型，少数为胞浆型；②在40倍物镜下，200万个像素单位内，肝组织HBcAg阳性细胞核平均个数92．85±50．15，阳性细胞核平均染色面积（70965．80±37919．20）像素单位，阳性细胞核平均光密度0．67±0．03，光密度比值2．37±0．09；③在肝细胞核内，HBcAg的表达不均匀，核周边的表达量较多。结论四项指标经统计分析，在门管区和中央静脉周围两个区间，HBcAg阳性细胞核平均个数、平均染色面积、平均光密度以及阳性细胞核与背景的光密度比值均没有统计学差异，且性别差异不显著。     

1.3拷贝C基因型HBV转基因小鼠的制备及检测

目的制备1.3拷贝C基因型HBV转基因小鼠,为乙肝的防治提供较好的动物模型。方法采用受精卵显微注射法,制备1.3拷贝C基因型HBV转基因小鼠;采用PCR、ELISA、荧光定量PCR和免疫组化方法检测HBV基因在转基因小鼠体内的整合、复制和表达情况。结果共注射受精卵2282枚,成活2024枚,注射成活率88.7%。共移植假孕雌鼠72只,59只怀孕,假孕雌鼠妊娠率81.9%。共产下F0代小鼠185只,PCR检测共有19只整合阳性,阳性率10.3%。血清荧光定量PCR结果显示,其中6只小鼠有HBV DNA复制,拷贝数为102~103拷贝/ml;经传代产下F1代小鼠96只,PCR检测HBV DNA阳性33只,阳性率34.4%。血清荧光定量PCR结果显示,其中10只小鼠有HBV DNA复制,拷贝数为102~103拷贝/ml;F0代和F1代小鼠随机分别各取3只进行肝脏和肾脏HBsAg免疫组化检测结果均为阳性,且肾脏表达高于肝脏。结论 1.3拷贝C基因可以在上述制备成功的C型HBV转基因小鼠体内复制和表达,并且可以遗传给下一代。