醛固酮对成骨细胞增殖分化及成骨相关基因表达的影响

目的 探讨外源性醛固酮对大鼠原代培养的成骨细胞增殖、碱性磷酸酶活性及成骨相关基因表达的影响及其机制.方法采用酶消化法体外培养大鼠成骨细胞,CCK-8试剂盒和AKP试剂盒分别检测成骨细胞的增殖和碱性磷酸酶活性情况,半定量RT-PCR和Western blotting检测成骨细胞骨形成活性相关标志物和上皮钠离子通道(α-ENaC)基因的mRNA和蛋白表达.结果与对照组相比,醛固酮浓度为1×10-2~1μmol/L范围内可以促进成骨细胞增殖,浓度为1×10-3μmol/L和10μmol/L时对成骨细胞增殖无显著影响;但醛固酮在1×10-3~10μmol/L浓度范围内对成骨细胞碱性磷酸酶活性均无明显影响.与对照组相比,醛固酮浓度为1×10-2~1μmol/L时均能上调成骨细胞中成骨细胞骨形成活性相关标志物I型胶原蛋白(Coll-Ia)、碱性磷酸酶(ALP)、骨桥蛋白(OPN)和α-ENaC基因的mRNA和蛋白的表达水平(P<0.05).结论醛固酮(1×10-2~1μmol/L)能明显促进成骨细胞增殖并上调成骨细胞骨形成活性相关标志物的表达,且同时上调ENaC基因的表达,提示ENaC可能是醛固酮调节成骨细胞功能的作用靶点之一.     

近交系和封闭群Wistar大鼠糖皮质激素致骨质疏松造模比较

目的比较近交系和封闭群wistar大鼠在地塞米松(dexamethasone,Dex)不同给药频率作用下骨量、骨结构和骨力学性能变化,为不同遗传背景大鼠的糖皮质激素性骨质疏松(glucocorticoid-induced osteoporosis,GIOP)模型制备提供实验依据。方法 3月龄SPF级两种品系雌性Wistar大鼠各32只采用数字法随机分为4组:近交系的对照组(J-C)和Dex低、中、高频给药组(J-L、J-M和J-H);封闭群的对照组(F-C)和Dex低、中、高频给药组(F-L、F-M和F-H),C组肌注0.9%氯化钠注射液(1 m L/kg,3次/周);L、M和H组分别肌注Dex(1 mg/kg,分别1、3、5次/周),共给药3个月,处死前进行2次荧光标记。取大鼠胫骨上段(proximal tibia,PTM)进行骨组织形态计量学分析,取股骨和第五腰椎行分别行三点弯曲和压缩试验测定。结果(1)与J-C组比较,J-M和J-H组生长板下骨小梁结构紊乱,各给药组静态参数差异均无统计学意义(P0.05);J-H组骨矿化沉积率(mineral apposition rate,MAR)、荧光周长百分率(percent fluorescence perimeter,%L.Pm)、骨形成率-组织(bone formation rate/tissue,BFR/TV)、骨形成率-体积(bone formation rate/volume,BFR/BV)和骨形成率-周长(bone formation rate/bone surface,BFR/BS)分别下降39.27%、61.92%、79.21%、75.08%和77.14%;单位骨小梁周长成骨细胞数(osteoblast number/unit trabecular perimeter,Ob.N/BS)、成骨细胞周长百分率(percent osteoblast perimeter,%Ob.S/BS)分别下降57.35%和61.16%;单位骨小梁周长破骨细胞数(osteoclast number/unit trabecular perimeter,Oc.N/BS)、破骨细胞周长百分率(percent osteoclast perimeter,%Oc.S/BS)分别下降50.29%、42.92%;最大载荷、最大应力、弹性载荷、股骨长度、最大断裂吸收能、骨材料韧性均显著下降(P0.05)。(2)与F-C组比较,F-M组和F-H组均呈骨量减少、骨结构破坏表现,F-H组MAR、%L.Pm、BFR/TV、BFR/BV、BFR/BS差异均有统计学意义(P0.05);Ob.N/BS和%Ob.S/BS分别下降87.36%、87.9%,Oc.N/BS、%Oc.S/BS分别增加186%、123%;三点弯曲及压缩参数均显著下降。结论以3、5次/周肌注Dex 1 mg/kg给药3个月,可以成功诱导封闭群Wistar大鼠GIOP成模,但未能使近交系wistar大鼠呈现低骨量效应,显示不同遗传背景个体及不同部位骨组织对糖皮质激素骨损伤效应有易感性差异。相对于骨量指标,反映骨结构、骨强度和骨形成功能的指标对糖皮质激素骨损伤效应较为敏感。     

非洲紫罗兰原生质体的制备及不同组分培养基对细胞增殖的影响

目的 探讨非洲紫罗兰（Saintpaulia ionantha）原生质体的制备方法,并比较不同组分培养基对原生质体再生及增殖的影响。方法 以非洲紫罗兰愈伤组织制备悬浮细胞,以细胞生长曲线确定最佳培养时间,并将纤维素酶（cellulase R-10）和果胶酶（pectolyase Y-23）按2︰1（质量比）混合分别酶解悬浮细胞18、20、24 h,比较原生质体得率和细胞活力以确定最佳酶解时间。分别以原生质体基础培养基提取愈伤组织提取物、根尖提取物及培养土浸出物配制培养基培养原生质体16 d,观察原生质体细胞壁再生并比较细胞增殖率。结果 悬浮细胞培养8天细胞增殖率最大,细胞活力93.8%; 4%（质量分数）纤维素酶和2%（质量分数）果胶酶混合酶解21 h原生质体得率达到峰值,细胞活力为75.2%,延长至24 h后得率与21 h相比,差异无统计学意义,但细胞活力降至69.5%。以不同组分培养基培养原生质体,最早于第6 d在愈伤组织提取物培养基中观察到再生细胞壁及细胞分裂;第16天,愈伤组织和根尖提取物培养基细胞增殖率显著高于原生质体基础培养基和培养土浸出物培养基,并以愈伤组织为佳,而培养土浸出物无促进作用。结论 以非洲紫罗兰愈伤组织悬浮细胞培养8 d并以4%纤维素酶和2%果胶酶混合酶解21 h能获得较多高活力的原生质体;愈伤组织提取物培养基能有效促进原生质体再生及细胞增殖。     

上皮钠离子通道对大鼠破骨细胞分化和骨吸收功能的影响

目的本文探讨上皮钠离子通道（ENaC）对破骨细胞功能和活性的影响。方法采用大鼠巨噬细胞集落刺激因子和核转录 因子-κB受体活化因子配体诱导大鼠骨髓单核细胞使其分化为破骨细胞。以1.5×104密度接种到12孔板,查随机表分3孔为1 组,分为4组：Control组和不同浓度阿米洛利（Ami, ENaC的抑制剂）组。抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色进行阳性破骨细胞 鉴定;将破骨细胞和骨片共同培养,测定骨吸收陷窝的数目;用RT-PCR技术分析破骨细胞标志酶基因组织蛋白酶K（CK）的表 达。结果不同浓度的Ami处理破骨细胞后,TRAP染色阳性破骨细胞减少,抑制破骨细胞的形成和骨吸收,而且降低破骨细胞 特异性基因CK的表达。结论本次实验在细胞水平证明ENaC在破骨细胞上的表达并且调控破骨细胞的分化和骨吸收,说明 ENaC可能参与破骨细胞的功能调节,提示破骨细胞可能存在一个与ENaC相关调节的新途径,为骨代谢的研究提供了一个新 思路。     

人纤溶酶原K1-3基因的表达及抗肿瘤作用研究

目的：研究人纤溶酶原K1-3基因的原核表达及其产物K1-3蛋白的抗肿瘤活性.方法：构建含K1-3基因的表达载体pBV-K13;转化E.coli DH5α;热诱导表达菌株E.coli DH5α（pBV-K13）的K1-3基因表达;表达产物经溶解、复性和纯化后进行鸡胚绒毛尿囊膜（Chorioallantoic membrane,CAM）活性分析和小鼠B16黑色素瘤抑制实验.结果：SDS-PAGE和Western blot分析结果证实K1-3基因在大肠杆菌中获得高效表达,表达产物对人纤溶酶原抗血清具有特异免疫活性,并抑制CAM毛细血管生成及小鼠B16黑色素瘤生长.结论：原核表达的K1-3蛋白具有抑制血管生成和抗肿瘤作用.     

rhBMP2与rhVEGF联合用药对大鼠成骨细胞及跖骨的作用

目的 观察rhBMP2（重组人骨形成蛋白-2）与rhVEGF（重组人表皮生长因子）联合用药对体外培养SD大鼠成骨细胞不同成熟阶段的增殖、分化及胎鼠跖骨生长的影响。方法分离新生大鼠颅盖骨的细胞培养获得前成骨细胞（preosteoblast,pOB）,再诱导分化为成骨细胞（osteoblast,OB）,以rhBMP2和低(2?g/L）、中(4?g/L)及高(8?g/L)剂量rhVEGF干预48h,比较乳酸脱氢酶（LDH）活性、细胞相对增殖率（RGR）和碱性磷酸酶（AKP）活性。另取胎鼠跖骨,以rhBMP2和rhVEGF干预7d和14d,比较其纵向骨生长率（longitudinal bone growth rate,LBDR）。结果 ①LDH组间差异无统计学意义。②RGR：pOB的中、高剂量联用组较同剂量rhBMP2组高。OB的中、高剂量联用组较同剂量rhBMP2及rhVEGF组高。③AKP：pOB的中、高剂量联用组较同剂量rhBMP2及rhVEGF组高。OB的组间差异无统计学意义。④LBDR;7d联用组较rhBMP2及rhVEGF组高,但14d联用组差异无统计学意义。结论 适量联用rhBMP2与rhVEGF对骨再生诱导及骨组织早期生长有协同促进效应。     

钠离子对幼年期雌性大鼠骨骼生长的影响

目的 应用骨形态计量学,研究不同浓度钠离子对幼鼠骨骼生长的影响及其机制.方法 5周龄雌性SD大鼠18只,随机分为3组,分别喂饲含钠量不同的鼠粮,正常组含钠1%,高钠组含钠8%,低钠组含钠0.13%,连续喂养60 d.每天监测饮水量、食量及定期测量体重.实验结束,动物处死取左侧胫骨分成两段,进行不脱钙骨包埋,骨形态计量学...     

不同频率糖皮质激素骨质疏松造模对大鼠肱骨的影响

目的研究地塞米松(Dex)对大鼠肱骨形态结构的影响。方法 3月龄♀SD大鼠37只,随机分为基础组(B组)、正常对照组(C组,肌肉注射生理盐水)和实验组[低、中、高频率组(L、M、H组)分别2次/周、4次/周、6次/周肌肉注射Dex,每次1.0 mg.kg-1],给药30 d后取肱骨脱钙、石蜡包埋,骨形态计量学分析骨量、骨结构变化情况。结果肱骨上段松质骨:B、C组差异无显著性;与C组比较,L组差异无显著性,M、H组骨小梁面积百分数(Tb.Ar%)明显降低(P<0.01),骨小梁宽度、数目明显减少(P<0.05),分离度明显增加(M组P<0.05;H组P<0.01)。肱骨中段皮质骨:B、C组差异无显著性;与C组比较,L、M组变化差异无显著性,H组骨组织总面积、皮质骨面积百分数、皮质骨厚度均明显减少(P<0.05),骨髓腔面积百分数明显增大(P<0.05)。肱骨生长板:B、C组差异无显著性;与C组比较,L、M和H组的生长板厚度均明显减少(P<0.05);L组肥大细胞直径变化无统计学意义,M、H组的肥大细胞直径明显减少(M组P<0.01;H组P<0.05)。结论短期、低频率(30d,每次1.0 mg.kg-1,2次/周)应用Dex不改变肱骨形态,当注射频率上升(4次/周)时仅观察到松质骨丢失,而皮质骨无变化,高频率时松质骨、皮质骨均严重丢失,3种频率用药均抑制肱骨生长板的生长发育,提示建立大鼠骨质疏松模型时应充分考虑不同用药频率对不同部位骨骼的影响,合理设计给药方案。     

淫羊藿提取物对体外培养成骨细胞的毒性试验及细胞效应研究

目的观察淫羊藿提取物（Epimedium Extract,EE）对体外培养大鼠成骨细胞（Ob）的毒性和增殖、分化的影响。[方法]大鼠颅盖骨细胞进行原代培养并定向诱导分化为Ob,分别以1～50ng／ml的不同浓度EE干预48小时,LDH活性检测EE．对细胞的毒性作用及安全剂量;以EE1ng／ml、5ng／ml和10ng／ml作为低、中、高剂量作用0b48小时,用cck-8法细胞增殖率检测0b增殖效应;以碱性磷酸酶（ALP）活性检测Ob分化效应。[结果]在1～10ng／ml浓度区间,LDH活性与对照组比较没有显著性差异;但20～50ng／ml的浓度区间,LDH活性显著上升并呈现浓度依赖性。中、高剂量组0b的增殖率明显高于低剂量组。低、中、高剂量组ALP活性比对照组有显著增加,但各组间没有显著性差异。[结论]EE≤10ng／ml时对0b无毒性作用;≥20ng／ml时对0b表现非特异性抑制的毒性作用。中、高剂量EE能促进Ob增殖;低、中、高剂量EE对Ob分化均有促进作用。