碱性成纤维细胞生长因子-慢病毒真核表达载体的构建及转染

背景：以往研究多采用质粒载体,由于其转染效率不高,且转染时需借助脂质体转染剂进行转染,转染具有细胞毒性,操作复杂等难以应用于临床。 目的：构建携带人碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)基因的慢病毒载体,转染成骨方向诱导的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),鉴定bFGF基因表达。 方法：实验组：设计人bFGF基因引物,用Trizol法提取胎盘组织RNA,用RT-PCR的方法扩增出bFGF基因,连接至pLenti6/V5-D-TOPO® 表达质粒,经Xho-Ⅰ、BamH-Ⅰ双酶切和DNA测序证实质粒正确构建。在脂质体转染剂Lipofectamine 2000的介导下,将bFGF-pLenti6/V5-D-TOPO表达质粒同包装质粒pLP1、pLP2、 包膜质粒pLP/VSVG 共转染293FT细胞株,收集bFGF-慢病毒上清转染诱导后第2代的兔BMSCs。对照组：设计GFP基因引物,以GFP- PMSLV-Plazmid为模板,PCR的方法扩增出GFP基因,连接至pLenti6/V5-D-TOPO® 表达质粒,构建GFP-慢病毒载体,并转染BMSCs。RT-PCR和Wetern-blot方法检测bFGF、GFP基因的表达。 结果与结论：转染48 h后,对照组BMSCs可见绿色荧光蛋白表达;实验组BMSCs在转染15 d后,RT-PCR方法扩增出bFGF基因,Western-blot检测出目的蛋白表达。提示成功构建携带人bFGF和GFP基因的真核表达载体,建立转染兔BMSCs的方法。     

甘草次酸类化合物的制备和抗肿瘤活性研究

目的制备18α-和18β-甘草次酸类复合物,并对体外抗癌活性进行研究。方法以18β-甘草次酸(Ⅰ)为起点,进行构型转化得到其光学异构体18α-甘草次酸(Ⅱ),再经C30-位羧基的甲酯化分别得到18β-甘草次酸甲酯(Ⅲ)和18-α-甘草次酸甲酯(Ⅳ),并与环磷酰胺的抗癌活性体内代谢产物——二氯磷酰氮芥偶联而得2个抗癌复合物18β-甘甲磷氮芥(Ⅴ)和18α-甘甲磷氮芥(Ⅵ);用四大光谱法(NMR、MS、IR、UV)对各化合物的化学结构进行鉴定分析;利用人类肝癌细胞株BEL-7402为体外实验模型,用MTT法观察各化合物对人肝癌细胞增殖的抑制活性;抗肿瘤药物顺铂作为阳性对照物。结果对化合物的合成工艺进行优化;18α-甘草次酸的构象转化得率为45%;目标化合物18β-甘甲磷氮芥(Ⅴ)和18α-甘甲磷氮芥(Ⅵ)的产率分别为35%和25%。所制备的甘草次酸衍生物中,化合物Ⅱ和Ⅵ对BEL-7402肿瘤细胞的增殖显示明显强的抑制活性,浓度在5～500μg/mL范围内,对肿瘤细胞增殖的抑制率分别为2.6%～86%及1.3%～50.1%;在相同条件下,对照物顺铂的抑制率为20.0%～73.41%。结论目标化合物的制备中磷酰酯化反应的条件控制(无水、物料比1∶1.25,温度65℃和反应时间3～4h)是合成关键;化合物Ⅱ和Ⅵ在中高浓度时,与顺铂具有较类似的抑制肝癌细胞增殖活性。甘草次酸类化合物的构型转化及与抗癌基团偶联可能提高其抗癌潜力。     

维吾尔药罗勒不同提取部位对ECV304和Raw264．7细胞毒性的相关研究

目的：确定维吾尔药罗勒的不同极性提取部位的细胞毒性,为后续研究提供可靠的实验依据。方法：采用MTT比色法筛遗出最佳的细胞铺板密度及给药浓度,并检测罗勒5个不同提取部位对ECV304和Raw264．7细胞的毒性作用,进而确定各部位药的IC50值。结暑：两种细碑在96孔板中的最佳接种密度均为1×10^5个／ml,在溶媒DMSO的最大终体积浓度为1％的条件下,OBL-乙醇、OBL-石油醚,OBL-氯仿,OBL-乙酸乙酯,OBL-正丁醇IC50值分别为320,62．4,29．3,84．8,258μg／ml。结论：维药罗勒各提取部位对ECV304和Raw264．7细胞有不同的毒性作用,为后续研究提供了较为可靠的实验依据。     

新疆维吾尔族妇女宫颈病变中DAPK表达的研究

[目的]探讨DAPK基因与新疆维吾尔族妇女宫颈病变的相关关系。[方法]选取维吾尔族妇女正常或炎症的宫颈组织30例、CINⅠ30例、CINⅡ/Ⅲ30例、宫颈鳞癌组织30例采用免疫组化SP法检测DAPK蛋白表达;为了进一步验证DAPK蛋白表达水平,采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测正常或炎症的宫颈组织10例、CINⅠ10例、CINⅡ/Ⅲ15例、宫颈鳞癌组织20例中mRNA的表达。[结果]DAPK的蛋白表达率在正常或炎症的宫颈组织、CINⅠ、CINⅡ/Ⅲ、宫颈鳞癌组织中分别为93.3%、83.3%、60.0%、33.3%,SCC组阳性表达率明显减少（P〈0.05）;四组mRNA的表达率分别为90.0%、90.0%、46.7%、10.0%,SCC组阳性表达率明显减少（P〈0.05）。宫颈组织中DAPK在蛋白水平和mRNA水平的表达均和宫颈病变程度成负关（P〈0.05）。[结论]新疆维吾尔族妇女宫颈病变组织中DAPK蛋白和mRNA水平均随病变程度加深而减少;DAPK蛋白检测可能为宫颈癌的早期诊断提供依据。     

重组慢病毒载体转染羊骨髓间充质干细胞及成骨基因表达量的变化

背景：碱性成纤维细胞生长因子具有促进骨髓基质细胞分裂增殖作用,而骨形态发生蛋白2在诱导新骨形成方面有重要的研究意义。目的：分析骨形态发生蛋白2和碱性成纤维细胞生长因子基因单独和联合转染对体外培养的骨髓间充质干细胞的增殖和骨向分化的影响,比较Ⅰ型胶原蛋白、骨钙蛋白、骨桥蛋白等非特异性成骨基因于转染前后骨髓间充质干细胞相对表达量的差别,为构建组织工程骨的种子细胞做理论依据。方法：构建碱性成纤维细胞生长因子、骨形态发生蛋白2慢病毒载体,分别转染羊骨髓间充质干细胞,得到碱性成纤维细胞生长因子组、骨形态发生蛋白2组、联合组、对照组细胞,提取RNA后采用实时定量PCR的方法检测Ⅰ型胶原蛋白、骨钙蛋白、骨桥蛋白等非特异性成骨基因的mRNA水平相对表达量的变化。结果与结论：对照组、碱性成纤维细胞生长因子、骨形态发生蛋白2及联合组4组间非特异性成骨基因表达量存在明显差异(P < 0.05),且碱性成纤维细胞生长因子和骨形态发生蛋白2具有交互作用(P < 0.05),碱性成纤维细胞生长因子、骨形态发生蛋白2联合组的Ⅰ型胶原蛋白和骨钙蛋白基因表达量明显高于其他3组,且差异有显著性意义(P < 0.05);但是骨桥蛋白基因中差异无显著性意义(P > 0.05)。体外实验结果显示联合转染组中的Ⅰ型胶原蛋白、骨钙蛋白、骨桥蛋白等非特异性成骨基因mRNA水平相对表达量较多,该组细胞的成骨功能最强,适合作为组织工程骨的种子细胞。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

骨髓间充质干细胞成骨方向诱导过程中的基因表达

背景:目前骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化演变中的基因表达模式尚不明确.目的:观察骨髓间充质干细胞向成骨细胞诱导分化过程中碱性磷酸酶、骨桥蛋白、I型胶原、碱性成纤维细胞生长因子和骨钙素基因的表达情况,验证骨髓间充质干细胞是否向成骨细胞成熟分化.方法:抽取2月龄新西兰大白兔股骨骨髓,全骨髓贴壁法培养获得骨髓间充质干细胞,用矿化诱导培养基(DMEM/F12、地塞米松1×10<'-8> mmol/L、β-磷酸甘油钠0.01 mol/L、维生素C 0.05 g/L)进行成骨诱导培养,用反转录一聚合酶链反应方法检测诱导培养后第一二代骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶、骨桥蛋白、I型胶原、碱性成纤维细胞生长因子和骨钙素基因的表达情况,并对该骨髓间充质干细胞表面抗原CD44进行鉴定.结果与结论:经矿化诱导培养基诱导培养后,第一二代骨髓间充质干细胞阶段性表达碱性磷酸酶、骨桥蛋白、I型胶原、碱性成纤维细胞生长因子和骨钙素基因;第1代骨髓间充质干细胞抗原CD44阳性率达44.4%.提示兔骨髓间充质干细胞在体外矿化诱导培养中逐渐向成骨细胞分化,分别于诱导后第一二代细胞中阶段性顺序表达成骨细胞特异性基因碱性磷酸酶、骨桥蛋白、I型胶原、碱性成纤维细胞生长因子和骨钙素,该细胞己具备成骨细胞特征,为揭示骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化过程中基因表达机制提供了实验依据.     

甲状腺乳头状癌组织中DAPK1与RARβ的表达及临床意义

目的：通过检测新疆地区甲状腺乳头状癌组织及甲状腺良性病变组织中DAPK1和RARβ的蛋白表达特点,探讨其在甲状腺乳头状癌发生发展中的意义。方法：采用免疫组织化学S-P法,检测DAPK1与RARβ在新疆地区38例甲状腺乳头癌、21例甲状腺良性腺瘤、13例桥本氏甲状腺炎、6例结节性甲状腺肿和6例癌旁正常甲状腺组织中的蛋白表达,并分析其与临床病理因素间的关系。结果：DAPK1在甲状腺乳头状癌中的阳性表达明显低于甲状腺腺瘤、桥本氏甲状腺炎、结节性甲状腺肿和癌旁正常甲状腺组织（P〈0.01）;RARβ在甲状腺乳头状癌中的阳性表达明显高于在甲状腺良性腺瘤、桥本氏甲状腺炎、结节性甲状腺肿和癌旁正常甲状腺组织（P〈0.01）;DAPK1与RARβ在甲状腺乳头状癌中的表达与患者的年龄、性别、民族无明显相关关系（P〉0.05）。结论：DAPK1可能参与了甲状腺乳头状癌的发生发展过程。检测DAPK1和RARβ的表达水平可作为判断甲状腺乳头状癌转移和预后的参考指标。     

严重高三酰甘油血症对小鼠生育及其后代糖脂代谢的影响

目的 严重高三酰甘油血症（hypertriglyceridemia,HTG）伴发于妊娠可能诱发急性胰腺炎,不良妊娠结局明显增高,但关于HTG对后代的远期影响如糖脂代谢的影响未见报道.本研究旨在探讨载脂蛋白CIII（apolipoprotein CIII,Apo CIII）转基因严重HTG的雌性小鼠对后代糖脂代谢的影响.方法应用Apo CIII转基因的严重HTG雌性及正常雌性小鼠分别与正常雄性小鼠交配,观察严重HTG雌性小鼠生育能力,并得到3组后代：母系为转基因的正常（maternal control,MC）和转基因后代（maternal transgenic,MT）及正常对照组（normal control,NC）.比较了上述3组小鼠出生体质量及生长速度、血浆三酰甘油（triglycerides,TG）、总胆固醇 （total cholesterol,TC）、糖代谢的差异.结果 Apo CIII转基因导致的严重HTG对雌性小鼠生育能力无影响,Apo CIII转基因的雌性小鼠所生育后代小鼠出生体质量及生长速度均与对照组差异常无统计学意义,MT组小鼠血浆TG及TC浓度于出生14及28 d均较MC及NC组显著升高（P〈0.01）,并出现轻度糖耐量受损,空腹胰岛素（fasting insulin,FINS）水平及稳态模型评估胰岛素抵抗指数（homeostasis model assessment-insulin resistant index,HOMA-IR）也较其他2组增高（P〈0.05）.结论Apo CIII转基因严重HTG的雌性小鼠可正常妊娠、分娩及哺乳.严重HTG的Apo CIII转基因小鼠可以通过母系遗传而导致转基因后代发生糖耐量受损,高胰岛素血症及胰岛素抵抗指数增高.     

维、汉族妇女宫颈病变中抑癌基因DAPK1、MGMT表达及其意义

目的:探讨O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(06-methylguanine-DNA methyl-transferase,MGMT)、死亡相关蛋白激酶(death associated protein kinase 1,DAPK1)抑癌基因表达水平与宫颈癌前病变病理进程的关系及其族群差异.方法:收集维吾尔族和汉族妇女宫颈炎、宫颈内上皮瘤样病变(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)和宫颈鳞癌患者石蜡包埋组织标本共218例,采用免疫组织化学方法检测MGMT、DAPK1蛋白表达水平.结果:DAPK-1阳性表达率在维、汉族妇女CIN Ⅱ/Ⅲ和宫颈鳞癌中均明显降低,低于宫颈炎/CIN Ⅰ(P(0.05);DAPK-1表达减弱与CIN、宫颈癌发生密切相关.MGMT在维、汉族宫颈病变病理进程中表达水平明显不一致,MGMT在汉族妇女宫颈炎/CIN Ⅰ、CIN Ⅱ/Ⅲ和宫颈鳞癌中的表达无递增或递减趋势;在维吾尔族妇女中阳性表达率随宫颈病变病理进程而升高,差异有统计学意叉(P<0.05).结论:DAPK1、MGMT基因的蛋白质表达水平变化与维、汉族妇女宫颈病变病理进程密切相关,为建立新一代族群和宫颈癌特异性早期诊断指标提供重要依据.     

维药罗勒提取物中总黄酮含量及其抗氧化活性研究

目的探讨维药罗勒乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物中总黄酮的含量及其体外抗氧化活性。方法采用紫外分光光度法,在357nm波长处测定维药罗勒乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物中总黄酮的含量,并进行比较;检测2种提取物对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH·)的清除作用,评价其体外抗氧化活性。结果维药罗勒乙酸乙酯提取物中总黄酮含量为21.023 3μg/mL(RSD 0.19%,n=5),正丁醇提取物中总黄酮含量为4.782 9μg/mL(RSD 0.58%,n=5)。0.5mg/mL乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物在体外对DPPH.的清除率分别为88.8%和72.2%。结论维药罗勒有效提取物中所含的黄酮可能是其发挥抗炎作用的有效化学成分之一,且其体外抗氧化活性也在一定程度上体现其体外抗炎活性。