PI3K/Akt信号通路参与大鼠骨髓间充质干细胞凋亡的发生

为研究体外大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)在缺血缺氧条件下发生凋亡的作用机制。采取大鼠骨髓,以密度梯度离心分离出单个核细胞(MNCs),于体外培养并由牛垂体提取物(PEX)诱导扩增传代培养出MSCs。经形态学和流式细胞仪检测MSCs表面标志物鉴定后,BMSCs在缺血缺氧条件下培养,通过Annexin V/PI双染细胞凋亡检测比较不同组别细胞的凋亡率和蛋白印迹法(western blot)来观察细胞中蛋白的变化。结果表明,①经形态学观察和流式细胞仪检测MSCs表面标志物鉴定,提示BMSCs培养成功。②对照组(无缺血缺氧)与缺血缺氧组比较,缺血缺氧组的凋亡率显著性增加,而通过磷酸化Akt的表达量显著性增加提示PI3K(phosphoinositide-3kinase)/Akt(proteinkinaseB,PKB)信号通路被激活(P<0.05);同时缺血缺氧组与缺血缺氧+PI3K/Akt抑制剂(LY294002)组比较,缺血缺氧+PI3K/Akt抑制剂组的凋亡率显著降低,而通过磷酸化Akt的表达量显著减少(P<0.05),提示...     

转化生长因子β1抑制食管癌细胞的生长

检测食管癌细胞系EC9706对转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)抑制生长作用的反应,并探讨其抑制肿瘤生长的机制。检测TGF-β1信号转导因子在食管癌细胞系EC9706中的表达。TGF-β1(10μg/L)刺激后食管癌细胞系EC9706细胞的增殖,信号转导因子在细胞内的转移和表达以及TGF-β1信号的靶基因p15、p16、p21、p27蛋白的改变情况。结果表明食管癌细胞系EC9706中TGF-β1信号转导因子均有表达,TGF-β1对食管癌细胞系EC9706有着较强的抑制生长作用。在TGF-β1刺激后磷酸化的Smad2以及Smad7在细胞内发生转移,而且蛋白表达量发生改变。此外TGF-β1诱导p27蛋白的表达升高,刺激后24h,p27表达量是刺激前和刺激后12h的3．2和2．7倍,而p15、p16、p21无变化。这些结果提示,TGF-β1信号通过下游Smad因子传人细胞核,并诱导p27表达增高,来抑制食管癌细胞的增殖。     

人融合蛋白基因GST-hPBD的构建、表达与纯化

为构建和纯化融合蛋白基因GST-hPBD，采用RT-PCR方法克隆与活化Racl相结合的hPBD基因片段，构建pGEX-2T／hPBD原核表达载体，于大肠杆菌中诱导表达并纯化GST-hPBD融合蛋白。结果表明，经基因测序证实融合蛋白原核表达载体pGEX-2T／hPBD构建正确，在大肠杆菌中GST-hPBD融合蛋白表达纯度大于70％，其分子量为36 kD；Pull down分析检测到血管内皮ECV304细胞表达活化Racl蛋白。本研究结果为检测血管内皮细胞活化Racl表达奠定了实验基础。     

肺腺癌高、低转移细胞系Anip973、AGZY83-a中野生型p53基因过表达研究

目的探讨野生型ｐ５３基因及其表达产物ｐ５３蛋白在恶性肿瘤基因治疗中的作用。方法应用腺病毒为载体将野生型ｐ５３基因转入高、低转移的肺癌细胞系Ａｎｉｐ９７３、ＡＧＺＹ８３－ａ,并且对各组转染细胞进行生长曲线、原位末端标记、Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｔｉｎｇ等技术检测分析。结果野生型ｐ５３蛋白的过表达对上述肺腺癌细胞系均呈现出较强的生长抑制作用,野生型ｐ５３蛋白的过表达对高转移肺癌细胞系Ａｎｉｐ９７３的抑制作用明显高于低转移细胞系ＡＧＺＹ８３－ａ。结论外源性野生型ｐ５３基因的过表达,可以有效抑制上述肿瘤细胞的增殖,同时对高转移肺腺癌细胞系的抑制作用更加显著。     

外源性野生型p53基因在两个肺腺癌细胞系中表达及对p16和p21基因的调控

目的 探讨p53基因在肺癌细胞周期中的作用机制，以及裸鼠体内基因治疗的作用。方法 用以腺病毒为载体的野生型p53基因pAdCMV-p53(Ad-p53)感染高转移肺腺癌95D细胞系和高浸润肺腺癌L-18系，对感染前后各细胞系的细胞生长曲线、p53、p16和p21基因的表达以及调亡进行分析。此外，用Ad-p53对两细胞系进行了裸鼠体内感染实验。结果 体外实验中，导入p53基因细胞系的生长均得到抑制，并且最终都出现凋亡，感染后的细胞中p53和p21基因的mRNA表达量明显增高，p16基因的mRNA表达量则无明显变化。p53基因治疗后的裸鼠，其中95D细胞系的肿瘤全部消失；L-18细胞系的腹腔注射组肿瘤全部消失，而皮下注射组无明显变化。结论 p53基因是一个有效的肿瘤抑制基因，其诱导细胞凋亡的途径与p16基因不同。腺病毒介导的野生型p53基因可以有效地控制肺癌细胞的发展和转移。     

高转移肺腺癌细胞系A2和A549中p16表达的研究

「目的」探讨肿瘤抑制基因对肺腺癌细胞生长的抑制作用。「方法」用ＦｕＧｅｎｅ传染方法将ｐ１６的表达质粒分别转入两个ｐ１６未表达的具高转移能力的肺腺癌细胞系Ａ２和Ａ５４９中，并对转染前后的肿瘤细胞进行了细胞生长曲线、凋亡检测、电镜和流式细胞仪分析。「结果」发现Ａ２、Ａ５４９细胞系转染后的细胞生长曲线的斜率要比转染前低得多，电镜分析也可看出转染前后的细胞形态发生了改变，但均未检测到凋亡信号。经流式细胞仪分析发现：转染后的细胞系均在Ｇ０～Ｇ１期发生阻滞。「结论」ｐ１６基因在Ａ２、Ａ５４９细胞中表达可以抑制其生长。对于发生了ｐ１６基因突变或缺失而导致ｐ１６蛋白在数量或功能上发生改变的恶性肿瘤，外源性ｐ基因的导入不失为一种治疗恶性肿瘤的有效途径。     

胚胎干细胞SM22α—EGFP表达克隆的建立及平滑肌细胞体外发育的动态观察

为探讨血管发育早期血管平滑肌细胞(VSMCs)募集和增殖特点,构建了含有SM22α启动子序列和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)编码序列的质粒,建立了平滑肌特异性蛋白SM22α启动子控制下稳定表达EGFP的胚胎干细胞株(ESCs),以研究VSMCs的发育特点。实验发现,起源于SM22α-EGFPESCs形成的类胚体(EBs)在第11天开启SM22α启动子并表达EGFP。此后EGFP阳性细胞持续增加,在第30天达到高峰。VSMCs多起源于EBs中细胞密集处,应用免疫荧光染色及RT-PCR观察到EGFP阳性细胞表达多种平滑肌特异性标志物。在贴壁培养的类胚体中VSMCs形态可分为纺锤形及上皮样的多角形,慢速视频显微摄像测得纺锤形细胞迁移速度较上皮形细胞快。结论:SM22α-EGFPESCs分化形成的EBs可以模拟体内早期胚胎血管形成过程,从形态学上获得VSMCs募集分化的证据。     

人肺癌不同转移表型细胞系的转移相关基因的研究

肺癌是我国高发肿瘤之一 ,而肺癌转移又是肺癌死亡的主要原因 ,因此研究肺癌的转移机制 ,寻找理想的肿瘤标志物 ,将为肺癌的预防和治疗的改善提供可靠依据。本研究应用人非小细胞肺癌转移表型不同的成对的细胞系Ａｎｉｐ973和ＡＧＺＹ ,ＰＧ和ＰＡａ进行肺癌转移相关基因的研究 ,避免了肿瘤患者取样的细胞污染 ,简便 ,经济 ,可靠。提取成对细胞系的总ＲＮＡ ,经分光光度计检测和电泳检测质量合格后用Ｃｙ3 ｄＵＴＰ和Ｃｙ5 ｄＵＴＰ分别标记肺癌高低转移细胞系ｍＲＮＡ ,与肺癌相关基因芯片杂交 ,扫描仪扫描芯片 ,用ＧｅｎｅＰｒｏ3 .0软件…     

利用胚胎干细胞建立贴壁制备类胚体的新方法

为改进类胚体制备过程中分化不同步等问题,探讨采用小鼠胚胎干细胞建立贴壁制备类胚体的新方法。当小鼠胚胎干细胞R1生长至70%~80%亚融合时,将其消化成单细胞,以1×106的细胞数接种到100mm组织培养皿中,用含低浓度白血病抑制因子(1ng/ml)的胚胎干细胞培养液连续贴壁培养3天后,收集贴壁细胞团继续悬浮培养。对悬浮培养的类胚体及其冷冻切片行形态学观察。结果发现该类胚体大小均一,分化同步,能展示从简单类胚体到成熟囊性类胚体的典型发育过程。免疫荧光染色观察到悬浮及贴壁分化的类胚体甲胎蛋白(AFP)、血小板内皮细胞粘附分子-1(PECAM-1)及神经丝蛋白68kD(NF-68)三种标志物表达均为阳性。结论:与目前常用的类胚体制备方法相比,本法操作简便,类胚体形成率高、分化阶段同步、结构典型,具有分化为三个胚层来源细胞的能力。     

E1A激活基因阻遏子在不同表型血管平滑肌细胞中的表达

为探讨血管平滑肌细胞表型转换、分化过程中E1A激活基因阻遏子(CREG)的表达变化及其相关机制，采用PCR扩增的CREG片段插人pGEX-4T-1原核表达载体，纯化的CREG融合蛋白免疫家兔以制备多克隆抗体；以人胸廓内动脉平滑肌细胞(HITASY)为模型，[^3H]标记脱氧胸苷掺人法测定去血清培养HITASY细胞DNA合成变化；Western blot观察HITASY细胞在去血清培养过程中SM仅α-actin、calponin的表达，RT-PCR和Western blot分析去血清培养诱导CREG mRNA和蛋白表达变化；免疫组化观察CREG在细胞内的表达及定位。结果成功地构建了载体并得到抗CREG多克隆抗体。去血清培养可使HITASY细胞DNA合成明显降低。随去血清培养时间延长，除SM α-actin和calponin表达逐渐上调之外，CREG mRNA转录活性和蛋白翻译合成亦上调。免疫组化显示去血清培养后，CREG蛋白在细胞内表达并主要位于细胞核周。结论：去血清能促使HITASY细胞由合成表型向收缩表型转换，同时伴CREG mRNA和蛋白表达上调。