HBV感染人胎盘滋养层细胞机制的初步探讨

目的 采用透射电镜观察HBV体外感染人胎盘滋养层细胞的超微结构变化.方法 HBV体外感染人胎盘滋养层细胞.ELISA检测培养上清中HBsAg,PCR检测细胞培养上清和滋养层细胞中的HBV DNA.HBV荧光定量PCR检测细胞培养上清中HBV DNA量(拷贝/ml).透射电镜观察滋养层细胞的超微结构.结果 感染组滋养层细胞培养上清中HBsAg在PBS清洗后12 h时A值为0.942,96 h时上升为1.264.PCR检测感染组细胞培养上清和感染组细胞HBV DNA均为阳性.PBS彻底清洗后0、12、36、60、84 h感染组细胞培养上清的HBV DNA分别为:＜103,3×104,6×105,5×105,3×105拷贝/ml.透射电镜观察到感染组滋养层细胞膜附近存在包涵素(Clathrin)形式的内吞小体形成,并且发现内吞小体内存在病毒颗粒样结构.在感染组细胞粗面内质网内发现HBsAg特异性的纤维丝状结构.结论 HBV可能经包涵素依赖的细胞内吞形式进入滋养层细胞,进而实现感染细胞或通过胞释作用将病毒排至细胞的对侧而实现穿越滋养层细胞屏障.     

陕西株庚型肝炎病毒(GBV-C/HGV )RNA NS3区 cDNA(4248nt～4465nt)的扩增、克隆和序列分析

目的　了解陕西株庚型肝炎病毒 (HGV,RNA/ GBV-C)的核苷酸序列特点 .方法　从陕西省西安市两位非甲、乙、丙、丁、戊型肝炎患者的血清中 ,应用反转录及套式 PCR技术 ,从血清中提取 RNA,经特异性的反转录引物 P4反转录成c DNA,以此为模板分别用 P3,P4及 P1 ,P2 两对引物进行PCR扩增 ,扩增到 2 18bp的 HGV RNA NS3区部分基因 ,将其克隆入 Pin Point TMXal- T载体 ,挑选阳性克隆并进行了序列分析 .结果　 SG2 与 HGV的核苷酸同源性分别为 85 .6 4%与84.48% ;与 GBV- C的核苷酸同源性为 86 .2 1%与 84.48% ,其二者之间同源性为 97.13% ;二者与 HGV的氨基酸同源性分别为 98.2 8%和 93.10 % ,与 GBV- C的氨基酸同源性也为98.2 8% ,93.10 % ,二者之间的氨基酸同源性达 94.83% .结论　庚型肝炎病毒 NS3区核苷酸同源性较高 ,同义突变率也较高 ,可能是一个对其生存环境较为适应的病毒 .     

退田还湖对生态环境及血吸虫病流行的影响

血吸虫病在全球的危害非常严重，且多年来无太大变化。我国主要分布在长江中下游的12个省、市、直辖区。建国后通过大规模的群众性防治工作，疫区面积大为缩小、居民患病状况明显改善，但1980年以来疫情呈现徘徊态势，局部地区呈严重回升趋势。2003年入夏以来，血吸虫病又出现了新的变化。在我国流行的人畜共患血吸虫病主要是日本血吸虫病，钉螺是日本血吸虫唯一的中间宿主。中国的钉螺根据外形分为肋壳和光壳2种，都可以传播血吸虫病。湖南8个县区为光壳钉螺，钉螺面积达2737．70万m^2。根据血吸虫病流行类型和中间宿主钉螺孳生地的类型，可分为江洲滩型、平原水网型和山丘型，以江洲滩型的发病率最高。血吸虫病的地理分布呈明显的地方性和间断性，重点分布在江湖洲滩地区。因此，我们针对洞庭湖区退田还湖带来的生态环境及对血吸虫病流行的影响进行了研究。     

人胎盘组织和滋养层细胞膜联素V的检测

目的检测膜联素V(AnnexinV)在人胎盘组织的表达及其分布,探讨乙肝病毒(HepatitisBVirus,HBV)感染胎盘细胞的可能方式.方法收集血清学HBsAg阳性孕妇足月胎盘组织39例、血清学HBsAg阴性孕妇足月胎盘组织4例,将培养的滋养层细胞制成细胞爬片,用免疫组化方法检测胎盘组织和滋养层细胞中的Annexin V.随机选取7例胎盘组织采用免疫荧光标记方法结合激光共聚焦技术对Annexin V进行重测.结果Annexin V存在于人类胎盘组织中,位于滋养层细胞、间质细胞及绒毛毛细血管内皮细胞的胞浆中.结论胎盘中含有丰富的AnnexinV,推测其可能是乙肝病毒进入滋养层细胞并感染胎儿的潜在受体.     

人早孕绒毛组织的体外原代培养和人滋养细胞株的建立

目的:建立快速、有效的绒毛滋养细胞体外原代培养的方法以及建立人滋养细胞株和初步评价。方法:采用胰酶和胶原酶I混合消化法消化绒毛组织,用胰蛋白酶消化传代体外培养,通过光镜、透射电镜和免疫荧光激光共聚焦方法对培养出的细胞进行形态和骨架评价。结果:显微镜下可见细胞呈多边形,细胞平铺生长,有细胞融合后形成的合体滋养层细胞;透射电镜下可见细胞表面的微绒毛丰富;胞质丰富,内质网扩张明显,有丰富的糖原颗粒、髓样小体和明显的脂滴,以及细胞间紧密的桥粒样结构连接;直接免疫荧光双标记染色检测到角蛋白18和波形蛋白均为阳性。结论:采用胰酶和胶原酶I混合消化法可获得较纯的滋养细胞,通过光镜、透射电镜和免疫荧光激光共聚焦检测细胞外形和骨架,确定该体外传至56代的细胞株为滋养细胞株。     

HBV全基因组克隆转染细胞系的建立

目的:建立HBV体外细胞培养体系. 方法:构建HBV全基因克隆质粒pcDNA3-3HBV,稳定转染HepG2细胞,G418筛选. ELISA检测细胞上清液HBsAg,HBeAg的表达,免疫组化检测细胞内HBcAg的表达,RT-PCR检测细胞S基因mRNA的表达,PCR检测细胞上清液DNA. 结果:成功构建了HBV全基因克隆质粒pcDNA3-3HBV,稳定转染HepG2后,培养上清HBsAg,HBeAg阳性,细胞内HBcAg呈核浆型分布,且以浆型分布为主. RT-PCR证实有HBV S基因 mRNA 的表达,上清中HBV S及前S基因阳性,荧光定量PCR检测显示培养上清中HBV 滴度达1×108拷贝/L. 结论:重组质粒pcDNA3-3HBV能在HepG2细胞中表达、转录、复制,该细胞培养体系能产生较高水平的HBV.     

乙型肝炎病毒全长基因的扩增

目的 为从全基因水平研究乙型肝炎病毒变异与致病性的关系，建立从血清及质粒标本经聚合酶链反应（PCR）扩增HBV全长基因的新方法，并初步进行克隆分析。方法 设计了含Sal I,Sap I酶切位点的引物，扩增3200 kb HBV全长DNA，经酶切及连接后克隆入载体。结果 用新建立的方法直接从少量血清中获得了全长HBV基因以及HBV全基因克隆。结论 该法可用于对HBV毒株的基因结构和功能的研究。     

不同孕期乙型肝炎病毒宫内感染率差别的荟萃分析

目的 分析不同孕期乙型肝炎病毒宫内感染率的差异，探索HBV宫内感染发生的时间。方法 运用Meta分析技术对9个不同孕期HBV母胎传播发生率研究进行定量综合分析。结果 孕早期的宫内感染率最低（0．48％），而孕晚期的感染率（14．07％）高于孕中期（4．33％）（d=0.1049,95.00%CI=0.052-0.158)。对各研究结果做齐性检验，未见显著差异（P＞0．05）。结论 HBV宫内感染可发生在孕期的各个阶段，但主要的发生时间是孕晚期。     

Adr亚型HBV转染人胎盘滋养层细胞株的体外研究

目的通过转染adr亚型HBV-DNA,建立可复制HBV的人胎盘滋养层细胞(HPT-8)。方法采用脂质体介导的方法将重组真核表达质粒pcDNA3-3HBV转染人胎盘滋养层细胞,经G418筛选,通过ELISA、免疫组化、PCR等方法对转染细胞和培养上清分别进行检测。结果HPT-8细胞稳定转染质粒pcDNA3-3HBV后,第1、2代转染细胞的培养上清ELISA检测显示HBsAg、HBeAg阳性,免疫组化检测显示转染细胞胞浆中HBsAg、HBcAg呈阳性信号,PCR检测培养上清中HBV-DNA呈阳性,荧光定量PCR检测其滴度达9×106拷贝/L,并且转染滋养细胞中有HBV-rcDNA和HBV-cccDNA存在。结论重组质粒pcDNA3-3HBV能在人滋养层细胞中表达、转录、复制。