人细胞核诱导凋亡因子1在大肠杆菌中的表达、纯化及多克隆抗体制备

目的:构建人核凋亡诱导因子1(NAIF1)原核表达质粒,在大肠杆菌中表达及纯化NAIF1融合蛋白,制备兔抗NAIF1多克隆抗体,并对其特性进行初步鉴定。方法:PCR法获得人NAIF1序列并将其克隆到原核表达载体pET-32a中,重组表达质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达蛋白,经变性、Ni+柱亲和纯化、复性后得到纯化的重组人NAIF1蛋白,免疫大耳白兔,制备兔抗人NAIF1多抗血清,以ELISA和Westernblot方法检测其效价和特异性。结果:成功获得了高纯度的人NAIF1重组蛋白和高效价的兔抗人NAIF1多抗血清,ELISA检测多抗效价达到1∶500000,Westernblot检测证明多抗特异性良好。结论:获得了高纯度的人NAIF1重组蛋白和兔抗人NAIF1多抗血清,为后续针对NAIF1基因功能的研究提供了重要实验材料。     

23,24-二氢葫芦素B抑制Nrf2-ARE通路逆转肝癌耐药的实验研究

目的探讨23,24-二氢葫芦素B(DHCB)抑制核因子E2相关因子2(Nrf2)/抗氧化反应元件(ARE)通路逆转肝癌细胞耐药的作用机制。方法采用阿霉素(ADM)浓度梯度递增法建立肝癌耐药细胞株Bel-7402/ADM,分为空白对照组、ADM组、DHCB组、ADM+DHCB组、DHCB+TBHQ组和DHCB+N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC)组。MTT法和平板克隆实验检测DHCB对Bel-7402/ADM细胞增殖活性的抑制作用;流式细胞术检测DHCB对Bel-7402/ADM细胞活性氧(ROS)含量和细胞凋亡。Western blotting法检测DHCB对Bel-7402/ADM细胞中Nrf2、醌氧化还原酶1(NQO1)、谷胱甘肽S转移酶-π(GST-π)、多药耐药相关蛋白1(MRP1)、cleaved caspase-3蛋白表达的影响。结果Bel-7402/ADM细胞对ADM的耐药指数RI为6.56;而经DHCB(4μmol/L)协同作用后,Bel-7402/ADM细胞对ADM的耐药指数RI为2.21。与空白对照组比较,ADM+DHCB组细胞克隆形成率明显降低(P<0.05);MRP1、Nrf2、NQO1和GST-π蛋白表达量下调,cleaved caspase-3蛋白表达量升高(P<0.05)。与Nrf2激活剂TBHQ合用后,DHCB抑制Nrf2/ARE通路的作用被逆转。与空白对照组比较,DHCB可上调Bel-7402/ADM细胞ROS表达水平;与DHCB组比较,DHCB+NAC组细胞ROS表达水平降低。DHCB可明显促进Bel-7402/ADM细胞凋亡。结论DHCB可增强Bel-7402/ADM细胞对ADM的敏感性,其作用机制可能为抑制Nrf2/ARE信号通路,进而促进肿瘤细胞发生氧化应激损伤,诱导细胞凋亡。     

利用pTet-Off系统研究NAIF1对食管癌细胞系EC9706生物学行为的影响

目的:利用pTet-off可诱导表达系统将NAIF1重组质粒导入食管癌EC9706中进行生物学行为影响研究。方法:构建pTRE2-NAIF1质粒,与PTK-Hyg质粒共转染入可诱导表达细胞系TF93(由EC9706构建而得),经筛选并鉴定获得稳定可诱导表达克隆。以此克隆采用MTT法检测细胞增殖、流式细胞术(FCM)检测细胞周期、Transwell小室法检测细胞迁移和检测细胞黏附能力的改变。结果:经筛选并鉴定获得了稳定的可诱导表达TF93-pTRE2-NAIF1克隆。NAIF1在体外可以抑制EC9706细胞增殖、导致G0/G1期细胞阻滞、抑制其迁移和黏附能力。结论:NAIF1能抑制食管癌细胞系EC9706的恶性生物学行为,为食管癌的基因治疗提供了可能的新靶点。