SHP-2C459/S突变体在三氧化二砷诱导的HEK293T细胞凋亡中的作用

目的 观察三氧化二砷(As2O3)对293T细胞凋亡和增殖的影响并探讨SHP-2在其中的作用.方法 显性负性SHP-2突变体SHP-2C459/S与具有绿色荧光蛋白基因的载体pEGFP-C1共转染人HEK293T细胞,Ho-echst33258染色检测细胞凋亡,细胞计数及荧光分光光度法检测细胞增殖.结果 SHP-2C459/S突变体能增强细胞凋亡和减轻增殖抑制.结论 SHP-2可能参与到As2O3诱导的细胞凋亡和增殖抑制的信号转导通路中.     

蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2对Ang Ⅱ刺激的心肌成纤维细胞增殖的影响

目的: 探讨含有Src同源结构域2的蛋白酪氨酸磷酸酶2 (Src homology 2 domain-containing protein tyrosine phosphatase 2, SHP-2) 对血管紧张素Ⅱ (angiotensin Ⅱ, Ang Ⅱ) 刺激的心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CFs)增殖的作用。方法: 差速贴壁法体外培养心肌成纤维细胞,以波形蛋白(vimentin)鉴定CFs纯度; MTT法检测Ang Ⅱ作用下心肌成纤维细胞增殖率,采用重组腺病毒过表达SHP-2和SHP-2抑制剂NSC-87877分别对Ang Ⅱ作用下的细胞增殖的影响。结果: Ang Ⅱ 对CFs增殖的促进作用有剂量依赖性,其促进细胞增殖的最高浓度为10^-7 mol/L;在AngⅡ 的刺激下,SHP-2可以促进心肌成纤维细胞增殖,并且突变体组比野生型组增殖更明显(P<0.01)。 SHP-2抑制剂NSC-87877达到50 μmol/L时可以明显抑制Ang Ⅱ刺激下的CFs增殖。结论: Ang Ⅱ的促CFs增殖作用是通过SHP-2调控的。     

SHP-2重组腺病毒的包装及对心肌细胞的感染

目的 采用HEK293细胞包装Ad-GFP-SHP-2和Ad-GFP-SHP-2-E76A并扩增Ad-GFP重组腺病毒并感染乳鼠心肌细胞.方法 纯化两种载体;Pac Ⅰ酶切线性化;线性化的载体转染入HEK293细胞进行包装;从病变的HEK293细胞分离重组腺病毒.利用重组的腺病毒感染乳鼠心肌细胞,并在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达.结景 Pac Ⅰ酶切后,琼脂糖凝胶上显示有4.5 kb的条带;转染线性化的重组腺病毒载体人HEK293细胞中,反复冻融HEK293,其上清中含有重组腺病毒,当感染乳鼠心肌细胞感染复数为100时,感染效率大于90%.结论 成功包装重组腺病毒,包装后的腺病毒可高效感染乳鼠心肌细胞.     

SHP-2在三氧化二砷诱导HEK293T细胞凋亡中的作用

目的探讨蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2在三氧化二砷(As2O3)诱导HEK293T细胞凋亡中的作用。方法将pIRES-GFP空载体、pIRES-GFP-SHP-2野生型和pIRES-GFP-SHP-2C459S突变体载体通过磷酸钙方法转染HEK293T细胞;在5μmol.L-1的As2O3孵育48 h后,用流式细胞术检测细胞凋亡率;Western blot方法检测Cyt-C、Caspase-3、p-ERK、ERK、p-JNK及JNK的表达变化。结果5μmol.L-1As2O3可诱导HEK293T细胞凋亡,SHP-2能抑制其作用;SHP-2C459S突变体组Cyt-C和Caspase-3表达均高于空载体组,SHP-2野生型组则低于空载体组;SHP-2野生型组p-ERK表达高于空载体组,SHP-2C459S突变体组则相反;p-JNK的表达,SHP-2C459S突变体组高于空载体组,而SHP-2野生型组低于空载体组。结论SHP-2可抑制As2O3诱导的HEK293T细胞凋亡,其机制可能与激活ERK和抑制JNK途径有关。