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二硫键稳定单链抗体融合PE38免疫毒素的构建及活性分析 总被引：7，自引：0，他引：7
目的构建二硫键稳定单链抗体(B3dsscFv)融合PE38原核表达载体,实现其高效表达,并对初步纯化后的复性产物的稳定性、对肿瘤细胞的结合和杀伤活性进行测定。方法重叠PCR连接B3抗体的VH和VL片段,并将PCR产物克隆至pET22b表达载体(B3dsscFv-pET22b)。测序正确的PE38基因片段经酶切连接至B3dsscFv-pET22b,构建B3dsscFv-PE38-pET22b表达载体。IPTG诱导转化菌,将表达的包涵体进行变性、复性后用阳离子柱Q-Sepharose进行了初步纯化,ELISA测定此融合蛋白中单链抗体的结合活性及其在37℃的稳定性,并采用MTT法检测其对B3抗原表面阳性细胞HT-29的杀伤作用。结果双酶切鉴定表明成功地构建了B3dsscFv-PE38-pET表达载体,表达产物以包涵体形式存在,占总蛋白量的45%左右。复性后的B3dsscFv-PE38保持单链抗体的结合活性,并且对结肠癌HT-29细胞具有一定的杀伤作用,最大杀伤率可达96%。该蛋白在37℃孵育16h后,仍能保持大部分活性。结论所获B3dsscFv-PE38免疫毒素具备导向和杀伤肿瘤细胞的双重功能和良好的稳定性,为其研制有效的肿瘤免疫治疗靶向药物提供一定的基础。 相似文献
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目的:构建人SUMO-2基因的原核表达载体,纯化融合蛋白GST-SUMO2-SUMO2并以其为抗原免疫家兔,制备人SUMO-2多克隆抗体.方法:用PCR的方法得到人SUMO-2基因并克隆至pET41a( )原核表达载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS诱导融合蛋白GST-SUMO2-SUMO2表达;所获得的可溶性蛋白经亲和层析纯化、SDS-PAGE电泳鉴定后,免疫家兔制备抗血清,分别采用ELISA、Western blot检测抗体效价和特异性.结果:测序证实重组质粒pET41a( )-SU-MO2-SUMO2构建成功;SDS-PAGE结果证实获得Mr为52 000的GST-SUMO2-SUMO2融合蛋白且为可溶性蛋白;经过GST亲和层析有效纯化;以该融合蛋白免疫家兔制备得到的抗血清经Western blot检测证实能与目的蛋白发生特异性结合,ELISA检测为阳性.结论:获得了人SUMO-2蛋白及特异性多克隆抗体,对进一步研究人SUMO-2及SUMO第二类家族的功能提供了有用工具. 相似文献
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