日本血吸虫信号蛋白编码基因表达质粒的构建

日本血吸虫以钉螺为中间宿主 ,各种野生和家养动物为保虫宿主 ,因此防治血吸虫病十分困难且代价昂贵。ＷＨＯ认为 ,作为化疗或其他措施的必要补充 ,应优先考虑人用血吸虫病疫苗的发展[1] ,但已知的候选疫苗 ,包括 1998年ＷＨＯ/ＴＤＲ推出的 6个最具潜力的疫苗候选分子的减虫率或减卵率低于 40 %。已知日本血吸虫信号蛋白 ( 14 3 3)广泛分布于真核生物细胞内 ,能结合原癌基因产物和癌基因产物 ,如多瘤病毒抗原、Ｒａｆ 1、Ｒａｓ、ｃｄｃ 2 5磷酸酶和ＰＫＣ等 ,在细胞信号转导通路中起调节作用[2 -4 ] 。国外已有有关人类 14 3 3用于克雅…     

人SUMO-1基因原核表达、纯化及多克隆抗体制备与鉴定

目的 构建人SUMO-1基因的原核表达载体,诱导表达重组蛋白,制备兔抗人SUMO-1抗血清.方法 从质粒pcDNA-HA-SUMO1-GG中用PCR方法克隆到编码人SUMO-1 N端97个氨基酸的基因片段,构建了SUMO-1原核表达载体pET41a(+)-SUMO1,转化大肠杆菌B121(DE3)pLysS,IPTG诱导蛋白表达并利用GST亲和层析柱进行纯化,以纯化后的融合蛋白GST-SUMO1为抗原免疫家兔,获得抗血清.Western blotting、ELISA法鉴定获得的抗血清.结果 成功构建原核表达载体,纯化到融合蛋白GST-SUMO1,用纯化的融合蛋白免疫家兔制备了多克隆抗体,Western blotting、ELISA法证实多克隆抗体制备成功.结论 成功获得了人SUMO-1多克隆抗体,为进一步研究人SUMO-1蛋白的功能奠定了基础.     

日本血吸虫(中国大陆株)信号蛋白14-3-3在原核细胞的高效融合表达和特性鉴定

目的　构建重组质粒pET2 8a -Sj14 - 3- 3,并在大肠杆菌中表达 ,检测表达产物的免疫活性。 方法　用亚克隆技术把Sj14 - 3- 3基因克隆至 pET2 8aT7启动子下游 ,转化大肠杆菌DH5α和BL2 1感受态细胞 ,经IPTG诱导表达 ,SDS -PAGE和Westernblot分析。结果　获得pET2 8a -Sj14 - 3- 3重组表达载体 ,SDS -PAGE和Westernblot显示Sj14 - 3- 3基因在 pET2 8a中表达的融合蛋白约为 32 4kDa ,与天然 14 - 3- 3蛋白具有相同的免疫活性。 结论　日本血吸虫信号蛋白14 - 3- 3在原核细胞中得以高效表达 ,表达产物具有免疫活性 ,为进一步研究其免疫保护作用和信号转导奠定了基础     

转录因子Sox2 SUMO修饰位点突变体的构建及真核表达

目的:构建Sox2及突变体Sox2 K247R的真核表达载体, 并在293FT细胞中表达.方法:以含有Sox2基因全长的馈赠质粒为模板, 用循环延伸PCR法得到该基因的突变体Sox2 K247R, 并将野生型及突变型基因定向亚克隆到真核表达载体pCMV-HA上.得到的重组质粒经限制性内切酶消化和DNA测序鉴定.其后用脂质体包埋法将pCMV-HA-Sox2及pCMV-HA-Sox2 K247R分别单独转染或与pCMV-Myc-SUMO1共转染293FT细胞.采用Western blot分析蛋白表达情况及SUMO修饰情况.结果:经酶切和DNA序列测定, 重组子序列正确, 突变体第247位密码子由AAG转变为CGG.Western blot结果显示野生型及突变型的Sox2都在细胞内得到了很好的表达, SUMO修饰位点突变后, Sox2不能与SUMO蛋白结合.结论:Sox2野生型及突变型真核表达载体构建成功, 在蛋白水平体现了SUMO修饰的差异性.     

人SUMO-2基因原核表达、纯化及多克隆抗体制备

目的:构建人SUMO-2基因的原核表达载体,纯化融合蛋白GST-SUMO2-SUMO2并以其为抗原免疫家兔,制备人SUMO-2多克隆抗体.方法:用PCR的方法得到人SUMO-2基因并克隆至pET41a( )原核表达载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS诱导融合蛋白GST-SUMO2-SUMO2表达;所获得的可溶性蛋白经亲和层析纯化、SDS-PAGE电泳鉴定后,免疫家兔制备抗血清,分别采用ELISA、Western blot检测抗体效价和特异性.结果:测序证实重组质粒pET41a( )-SU-MO2-SUMO2构建成功;SDS-PAGE结果证实获得Mr为52 000的GST-SUMO2-SUMO2融合蛋白且为可溶性蛋白;经过GST亲和层析有效纯化;以该融合蛋白免疫家兔制备得到的抗血清经Western blot检测证实能与目的蛋白发生特异性结合,ELISA检测为阳性.结论:获得了人SUMO-2蛋白及特异性多克隆抗体,对进一步研究人SUMO-2及SUMO第二类家族的功能提供了有用工具.